基于HPLC指纹图谱和含量测定的半边莲饮片与标准汤剂量值传递规律研究

李振雨,刘晓霞,冯涌微,位翠杰,何民友,夏天睿,陈向东,孙冬梅

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室,佛山 528244

半边莲为桔梗科植物半边莲LobeliachinensisLour.的干燥全草,具有清热解毒,利尿消肿的功效[1]。研究显示,半边莲主要含黄酮、生物碱和香豆素类成分[2],具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、镇痛等药理作用[3-7]。半边莲为药典常用中药,但药典项下半边莲药材质量标准只收载性状、鉴别、检查和浸出物项,质量标准尚不完善。目前关于半边莲质量控制研究及成分分析的报道仍比较少[8]。

传统中药以汤剂为主要用药形式,汤剂为中药发挥药效的物质基础,经过千年的临床实践,因此,建立中药标准汤剂的质量标准,能够为中药配方颗粒等现代中药制剂质量标准的建立提供重要参考[9,10]。目前,关于半边莲标准汤剂的研究报道尚未见到。本文作者在研究半边莲配方颗粒国家标准时,按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[11](以下简称《技术要求》),对标准汤剂的关键质量指标:出膏率、浸出物、指标性成分含量及转移率、指纹图谱进行研究,考察半边莲饮片到标准汤剂的量值传递规律,为半边莲配方颗粒及其相关制剂质量标准的制定提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(e2695,沃特世公司);Thermo Acclaim C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;百万分之一天平(XP26,梅特勒-托利多公司)。

1.2 试剂

分析级甲醇、磷酸二氢钾(西陇科学股份有限公司);分析级二甲基亚砜(阿拉丁试剂有限公司);液相用乙腈(纯度≥99.9%,默克股份有限公司)。

1.3 试药

地奥司明(批号:101348-201802,含量:97.3%)、蒙花苷(批号:111528-201911,含量:98.5%)对照品购自中国食品药品检定研究院;木犀草素7-二葡萄糖苷酸对照品(批号:STD210928082,纯度大于95.0%,成都德思特生物技术有限公司);海常黄苷对照品(批号:B20210512,纯度大于98.0%,四川维克奇生物科技有限公司);半边莲对照药材(批号:121142-201605,中国食品药品检定研究院)。

21批半边莲药材经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为桔梗科植物半边莲LobeliachinensisLour.的干燥全草。取21批半边莲药材,参照2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)半边莲饮片项下规定制成21批半边莲饮片,并按照《技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》[12]制备21批半边莲标准汤剂样品。半边莲饮片和标准汤剂的产地信息见表1所示。

表1 半边莲饮片和标准汤剂产地信息表

2 方法与结果

2.1 半边莲饮片的炮制和标准汤剂的制备

2.1.1 半边莲饮片的炮制

参照2020年版《中国药典》一部半边莲饮片项下炮制规定,细化炮制参数,确定半边莲饮片的炮制方法为:取药材,除去杂质,洗净(1 min内),切段(5～10 mm),置60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥5～6 h,即得半边莲饮片,经检验均符合2020年版《中国药典》的规定。

2.1.2 半边莲饮片标准汤剂的制备

取半边莲饮片100 g,加水煎煮两次,一煎加水12倍量,浸泡30 min,武火(500 W)加热煮沸后文火(200 W)保持微沸30 min,趁热过滤,滤液迅速用冷水冷却;二煎加水10倍量,武火(500 W)加热煮沸后文火(200 W)保持微沸25 min,趁热过滤,滤液迅速用冷水冷却;合并两次滤液,减压浓缩,冷冻干燥,得标准汤剂冻干粉。

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Acclaim C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(B);梯度洗脱(0～24 min,10%→14%A;24～28 min,14%→22%A;28～35 min,22%A;35～41 min,22%→30%A;41～53 min,30%→33%A);流速为1.0 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为340 nm;进样量为10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

取木犀草素7-二葡萄糖苷酸、海常黄苷、地奥司明和蒙花苷对照品适量,溶解于二甲基亚砜中,制成适量的混合对照品溶液。精密移取上述混合对照品溶液适量,加甲醇制成每1 mL含木犀草素7-二葡萄糖苷酸4.21 μg、海常黄苷2.23 μg、地奥司明1.75 μg和蒙花苷1.62 μg的混合溶液,即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.3.1 半边莲饮片供试品溶液的制备

取本品粉末(过二号筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定重量,加热回流30 min,取出,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3.2 半边莲标准汤剂供试品溶液的制备

取半边莲标准汤剂适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,取出,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3.3 半边莲对照药材供试溶液的制备

取本品约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定重量,加热回流30 min,取出,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,取续滤液,即得。

2.2.4 指纹图谱方法学验证

2.2.4.1 精密度考察

取半边莲标准汤剂(编号:BT3)适量,研细,取约0.5 g,精密称定,按“2.2.3.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次,以地奥司明色谱峰为参照峰S,计算其余各共有指纹峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.07%～0.27%,相对峰面积RSD值在1.12%～2.64%,均小于3.0%,表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重复性试验

取同一批半边莲标准汤剂(编号:BT3)适量,研细,取约0.5 g,精密称定,平行6份,按“2.2.3.2”项下方法制备6份供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行分析,以地奥司明色谱峰为参照峰S,计算其余各共有指纹峰与S峰的相对峰面积RSD值在0.14%～0.36%,相对峰面积RSD值在0.60%～2.73%,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。

2.2.4.3 稳定性试验

取重复性试验项下供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件,分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定,以地奥司明色谱峰为参照峰S,计算其余各共有指纹峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.10%～0.27%,相对峰面积RSD值在0.50%～2.81%,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。

2.2.5 指纹图谱的建立及共有峰的指认

采用“2.2.1”和“2.2.3”项下方法测定21批半边莲饮片和标准汤剂样品指纹图谱,导出指纹图谱CDF格式,导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)》,分别以YP1和BT1样品指纹图谱为参照图谱,时间窗为0.2 min,进行多点校正和峰匹配,并生成饮片和标准汤剂对照指纹图谱,21批半边莲饮片和标准汤剂指纹图谱叠加图见图1和图3,对照指纹图谱见图2和图4。结果显示,21批半边莲饮片和标准汤剂指纹图谱均标识出11个保留时间一致的共有峰,并与半边莲对照药材指纹图谱的11个色谱峰相对应,说明从半边莲饮片到标准汤剂,各共有峰均能传递到标准汤剂中,对照药材指纹图谱见图5所示。 取“2.2.2”项下混合对照品溶液和半边莲标准汤剂(编号:BT3)供试品溶液,采用“2.2.1”项下色谱条件进行分析,与对照品保留时间和紫外吸收光谱比对,确定峰1为木犀草素-7-二葡萄糖苷酸,峰2为海常黄苷、峰10为地奥司明、峰11为蒙花苷,对照品指认结果见图6所示。

图1 21批半边莲饮片指纹图谱叠加图Fig.1 Superimposed fingerprint of 21 batches of Lobeliae Chinensis Herba decoction pieces

图2 半边莲饮片对照指纹图谱Fig.2 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba decoction pieces

图3 21批半边莲标准汤剂指纹图谱叠加图Fig.3 Superimposed fingerprint of 21 batches of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction

图4 半边莲标准汤剂对照指纹图谱Fig.4 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction

图5 半边莲对照药材指纹图谱Fig.5 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba

图6 半边莲标准汤剂指纹图谱共有峰指认Fig.6 Identification of common peaks in the fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction注:A:混合对照品溶液,B:供试品溶液。1:木犀草素-7-二葡萄糖苷酸;2:海常黄苷;10:地奥司明;11:蒙花苷。Note:A:Mixed reference solution;B:Sample solution.1:Luteolin-7-diglucosidic acid;2:Clerodendrin;10:Diosmin;11:Linarin.

2.2.6 相似度评价

计算21批半边莲饮片和标准汤剂样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,结果见表2,21批半边莲饮片指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.912～0.976,饮片指纹图谱的整体相似度较高,指纹图谱可以作为共性特征用于半边莲饮片的质量控制;而21批半边莲标准汤剂指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.840～0.943,从饮片到标准汤剂,指纹图谱的相似度变化较大,考虑半边莲指纹图谱共有峰所代表的化学成分在水中的溶解度不同,从饮片到标准汤剂各成分的转移率波动较大,导致共有峰的比例发生较大变化有关。

表2 相似度计算结果

2.2.7 化学计量学分析

2.2.7.1 主成分分析(PCA)

以峰10地奥司明色谱峰为参照峰S,计算其余各共有峰的相对峰面积,以共有峰的相对峰面积为变量导入SIMCA14.1软件进行PCA分析,结果见图7所示,PCA模型共提取出5个主成分,R2X为0.978,Q2为0.865,证明模型有效,结果显示,21批半边莲饮片聚为一类,在模型中的聚集程度较高,而对应的标准汤剂聚集程度较为分散,归为另一类,与相似度计算结果相一致,说明从饮片到标准汤剂各共有峰的比例发生较大变化,而标准汤剂不同批次之间也存在较大的差异,需要进一步研究。

图7 PCA得分图Fig.7 PCA scores plot

2.2.7.2 正交偏最小二乘法-判别式分析(OPLS-DA)

以共有峰的相对峰面积为变量进行OPLS-DA分析,研究从饮片到标准汤剂各共有峰的相对峰面积变化,模型采用200次置换检验,R2和Q2值右边均大于左边,说明模型无过度拟合现象,结果见图8。R2X值为0.938,R2Y为0.894,Q2为0.855,均大于0.5,证实模型有效,21批饮片和标准汤剂OPLS-DA得分图见图9所示,两类样品区分较为明显,以VIP>1.0寻找差异显著性变量,结果见图10,共找到5个差异性变量,按VIP值大小进行排序,分别为峰9>峰7>峰5>峰4>峰1,表明上述5个峰的相对峰面积从饮片到标准汤剂相对峰面积变化整体较为显著。

图8 OPLS-DA模型置换检验Fig.8 OPLS-DA model replacement test

图9 OPLS-DA得分图Fig.9 OPLS-DA score plot

图10 VIP图Fig.10 VIP plot

2.3 出膏率测定

出膏率以冻干粉量计,出膏率=标准汤剂冻干粉重量/饮片重量×100%,结果见表3。21批半边莲标准汤剂出膏率范围在29.91%～47.94%,出膏率均值为40.93%,标准偏差(SD)为5.45%,出膏率均值的70%～130%范围为28.65%～53.20%,出膏率数值均在均值±30%范围内,符合《技术要求》的规定。

表3 出膏率和浸出物含量测定结果

2.4 浸出物测定

取半边莲标准汤剂适量,研细,取约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入乙醇100 mL,按《中国药典》2020年版通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定,结果见表3。21批半边莲标准汤剂浸出物范围在22.19%～36.36%,浸出物均值为29.55%,SD为4.24%,均值的70%～130%范围为20.68%～38.41%,浸出物数据均在均值±30%范围内,符合《技术要求》的规定。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液(B);梯度洗脱(0～31 min,15%→35%A);流速为1.0 mL/min;柱温为30 ℃;检测波长为340 nm;进样量为10 μL。

2.5.2 对照品溶液的制备

精密称定地奥司明对照品2.336 mg、蒙花苷对照品2.027 mg,置25 mL量瓶中,加二甲基亚砜制成每1mL含地奥司明90.917 μg、蒙花苷79.864 μg的混合溶液,精密移取上述混合溶液0.5 mL置25 mL量瓶中,加甲醇制成每1 mL含地奥司明1.818 μg、蒙花苷1.597 μg的混合溶液,即得。

2.5.3 供试品溶液的制备

2.5.3.1 半边莲饮片供试品溶液的制备

取本品粉末(过二号筛)约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入二甲基亚砜25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)45min,取出,放冷,再称定重量,用二甲基亚砜补足减失的重量,离心(转速为4 000 r/min)5 min,精密移取上清液10 mL置25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.5.3.2 半边莲标准汤剂供试品溶液的制备

取半边莲标准汤剂适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30min,取出,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.5.4 方法学验证

2.5.4.1 精密度试验

精密吸取半边莲标准汤剂溶液,按照“2.5.1”项下色谱条件重复进样6次,计算地奥司明和蒙花苷峰面积RSD值分别为0.58%和0.55%,均小于3.0%,表明仪器精密度良好。

2.5.4.2 重复性试验

取同一批半边莲标准汤剂(编号:BT14)适量,研细,约0.5 g,精密称定,平行6份,按“2.5.3.2”项下方法制备供试品溶液6份,按“2.5.1”项下色谱条件测定地奥司明和蒙花苷的含量分别为0.207 mg/g和0.084 mg/g,RSD值为0.83%和0.99%,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。

2.5.4.3 线性考察

取地奥司明和蒙花苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含地奥司明94.323 μg、蒙花苷48.817 μg的混合对照品母液。精密量取上述混合对照品母液1.0mL,分别置2、5、10、25、50、100 mL量瓶中,加甲醇制成每1mL含地奥司明47.162、18.865、9.432、3.773、1.886、0.943 μg,蒙花苷24.408、9.763、4.882、1.953、0.976、0.488 μg的混合对照品应用液,分别精密吸取上述混合对照品母液和应用液,按照“2.5.1”项下色谱条件依次进样10μL,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(Y),对照品浓度为横坐标(X),绘制线性回归方程,地奥司明的线性回归方程为Y=21 468X+4 797.3,蒙花苷的线性回归方程为Y=22 207X+2 443.5,相关系数r均大于0.999 5,表明各成分在规定的对照品浓度范围内,峰面积与对照品浓度线性关系良好。

2.5.4.4 准确度试验

精密称取地奥司明对照品9.694 mg,置20 mL量瓶中,加二甲基亚砜制成每1 mL含地奥司明471.613 μg的对照品储备液①;精密称取蒙花苷对照品2.478 mg,置10 mL量瓶中,加二甲基亚砜制成每1 mL含蒙花苷244.083 μg的对照品储备液②。精密移取上述对照品储备液①2.8 mL、对照品储备液②2.2 mL,置25 mL量瓶中,加70%甲醇制成每1 mL含地奥司明52.821 μg、蒙花苷21.479 μg的混合对照品加样母液。取半边莲标准汤剂(编号:BT14)适量,研细,约0.25 g,精密称定,置9个25 mL量瓶中,平行3组,每组3份,采用加样回收法,按对照品加入量与供试品待测成分的含量之比控制在0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例分别加入上述对照品加样母液0.5、1.0、1.5 mL,再加70%甲醇定容至刻度,按“2.5.3.2”项下方法制备供试品溶液9份。按“2.5.1”项下色谱条件测定,计算地奥司明的平均加样回收率为98.57%、蒙花苷的平均加样回收率为96.58%,RSD值分别为1.22%和1.46%,均小于3.0%,表明该方法准确性良好,结果见表4。

表4 加样回收率测定结果

2.5.4.5 稳定性试验

精密吸取半边莲标准汤剂(编号:BT14)供试品溶液,按照“2.5.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12和24 h进样测定,计算地奥司明和蒙花苷的色谱峰面积RSD值分别为0.38%和0.27%,均小于3.0%,表明供试品溶液稳定性良好。

2.5.5 样品测定和转移率计算结果

采用“2.5”项下含量测定方法对21批半边莲饮片和标准汤剂地奥司明和蒙花苷的含量进行测定,含量以干燥品计,并计算转移率,转移率=标准汤剂中有效成分的总量/饮片有效成分总量×100%,结果见表5。结果显示,21批半边莲饮片地奥司明的含量范围在1.97 ～6.55 mg/g,蒙花苷的含量范围在0.28～0.96 mg/g,21批半边莲标准汤剂地奥司明的含量范围在0.15 ～0.54 mg/g,均值为0.27 mg/g;地奥司明的转移率范围在1.53%～4.99%,均值为2.77%;蒙花苷的含量范围在0.06 ～0.15 mg/g,均值为0.10 mg/g;转移率范围在4.27%～8.98%,均值为6.66%。

表5 地奥司明和蒙花苷的含量和转移率测定结果

3 讨论与结论

半边莲质地较轻,在饮片煎煮过程中,大量成分溢出,增加了指纹图谱的建立难度,在指纹图谱的建立过程中,综合考虑图谱信息量、色谱峰响应和分离效果,考察了甲醇-0.1%磷酸溶液,乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液3种流动相系统,最终选择乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液。采用全波长扫描模式,确定了指纹图谱最佳吸收波长,以“指纹图谱共有峰的总峰面积/称样量”为指标,优选出最佳的供试品溶液制备方法,所建立的指纹图谱方法经系统方法学验证,均符合要求。2020年版《中国药典》一部“半边莲”项下无含量测定指标,参考《香港中药材标准》、Zeng等[13]研究结果,建立有效成分地奥司明和蒙花苷的含量测定方法,从而指导标准汤剂的量值传递研究。产地调研显示,半边莲主产于贵州、安徽、江西、湖南、湖北、河南等地,以野生资源为主,为保证样品的代表性,我司工作人员深入到半边莲主产地进行样品的搜集,以满足标准汤剂研究的需要。从标准汤剂的出膏率、浸出物和含量测定结果来看,21批半边莲标准汤剂出膏率、浸出物、地奥司明和蒙花苷的含量均存在一定的差异,出膏率和浸出物最大值是最小值的1.6倍左右,地奥司明和蒙花苷含量最大值是最小值的2～4倍。这种差异可能与药材的产地、采收时间和产地加工方式的不同有关。

2020年版《中国药典》半边莲药材项下并无含量测定指标, 黄酮类化合物是半边莲中非常重要的一类化合物,是抗癌的主要活性成分,其中地奥司明为黄酮苷化合物,具有改善静脉通透性,改善微循环的作用[14],蒙花苷与地奥司明结构非常相似,且在半边莲中含量较高,因此,药材和饮片采用地奥司明和蒙花苷为含量测定指标,具有一定的专属性和实际意义。但从转移率计算结果来看,地奥司明和蒙花苷从饮片到标准汤剂的转移率均小于10%,说明其水溶性并不理想,从指纹图谱各共有峰的比例就能明显看出,地奥司明和蒙花苷色谱峰从饮片到标准汤剂,其在指纹图谱总峰面积中的占比明显下降。考虑到目前从半边莲指纹图谱指认出的其他成分缺乏已知含量的法定对照品,对水溶性较大成分的转移情况分析有待于进一步研究。根据PCA结果可知,从半边莲饮片到标准汤剂,共有峰的相对峰面积产生明显变化,OPLS-DA共找到5个相对峰面积变化较为显著的色谱峰,分别为峰9、峰7、峰5、峰4和峰1,考虑与各共有峰所代表的化学成分的转移率差异有关。

本次研究,以标准汤剂的出膏率、浸出物、指纹图谱、有效成分的含量及转移率为考察指标,分析半边莲饮片到标准汤剂的量值传递过程,为半边莲配方颗粒及其相关制剂的质量标准的制定提供参考。