山银花油GC-MS及LC-MS的全成分表征及体外抗炎和抗氧化活性研究

刘恃君,陆玉爱,李 利,汤杨黔南,林丽美,谢明霞,夏伯候

湖南中医药大学药学院 湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室,长沙410208

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、华南忍冬LoniceraconfuseDC.或黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花[1]。山银花主要用于治疗外感风热或流行性热病的早期感染、疮、痈、疖和肿等细菌和病毒诱导的以热、红、痛和肿为主的炎症过程[2]。山银花是中成药维C银翘片、感冒止咳糖浆和复方大青叶合剂等大品种的主要组成药物。此外,山银花还经常被用作生产各种保健品的原料,如茶和酒等。

大量植物化学研究表明山银花中含有黄酮类化合物、有机酸、环烯醚萜、皂苷和油[3,4]。然而,对其油的化学成分和生物活性进行深入研究的文献较少。从研究方法上可得,报道文献主要采用气质联用(GC-MS)及顶空固相萃取结合气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术。从提取方法上可得,主要采用的是超声、微波、索氏提取及水蒸气蒸馏等[5,6]。从提取方法的广度看,CO2超临界提取得到油的研究较少。从检测方法的全面性看,缺少油中中等极性物质的检测。此外,山银花油具有较好的生物活性,值得进一步的开发研究[7]。

因此,本研究以山银花油为研究对象,应用CO2超临界萃取得到山银花油;通过甲酯化及非甲酯化结合GC-MS分析油中的挥发性及小极性成分;通过超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-QE-MS)结合标准品谱库鉴定油中的中等极性成分。以期全面解析山银花的化学成分。同时,本研究采用体外抗氧化方法和体外细胞抗炎试验评估山银花油的抗氧化及抗炎活性,为其进一步的开发利用提供科学指导。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

HL-2L-50-IIIB超临界流体二氧化碳萃取装置(杭州华赛泵业设备有限公司);GCMS-QP2020NX气相色谱质谱联用仪(日本Shimadzu公司);1290 UPHLC超高效液相(美国Agilent公司);Q Exactive Focus高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific);EnSpire多功能酶标仪(美国哲成科技有限公司);BEH C18色谱柱(美国沃特世公司)。

小鼠巨噬细胞RAW 264.7(中国科学院上海细胞库);阳性药物地塞米松(DXMS,批号:D8040,北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(批号:27250-018,美国Hyclone公司);MTT(批号:1003010349,Sigma公司);脂多糖(LPS,批号:12171104,Sigma公司);小鼠白细胞介素6高敏ELISA试剂盒(批号:MU30044,武汉贝茵莱生物科技有限公司);NO Griess试剂盒(批号:202003,碧云天生物技术研究所);ABTS试剂盒(批号:070319191112,上海碧云天生物技术有限公司);C10～C40偶数碳正构烷烃(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO,分析纯,纯度≥99.9%,Sigma公司);其他试剂均为分析纯。

山银花药材购自长沙市高桥药材市场,经湖南中医药大学药学院王智老师鉴定为忍冬科忍冬属植物华南忍冬LoniceraconfuseDC.的干燥花蕾。标本存放于湖南中医药大学湘产大宗重点实验室(编号20210416)。

1.2 精油提取

山银花药材打粉,真空干燥后过60目筛,将干粉置于超临界流体萃取设备中。萃取釜温度为45 ℃,萃取压力为25 MPa;分离釜1的温度为50 ℃,萃取压力为5 MPa;分离釜2的温度为55 ℃,萃取压力为5 MPa。提取时间为3 h,获得油,将油样品置于50 mL离心管并存放于-20 ℃的冰箱中备用。

1.3 GC-MS分析

1.3.1 非甲酯化前处理及分析

精密称取12 mg油样品,用正己烷定容至10 mL容量瓶,并用0.22 μm微孔过滤器过滤混合物。同时取C10～C40正构烷烃标准品适量,待GC-MS检测。

GC条件:石英毛细管色谱柱Rtx-5MS色谱柱(30m×250 μm,0.25 μm);载气:氦气(纯度为99.99%);载气流速:0.76 mL/min;载气压力:57.4 kPa;进样口温度:270 ℃;温度程序为:初始温度120 ℃,2 min;120～220 ℃,20 ℃/min;220～250 ℃,3 ℃/min;250～300 ℃,2 ℃/min,10 min;进样量:1 μL;分流比:20∶1。

MS条件:电子电离源:70 eV;离子源温度:200 ℃;接口温度:280 ℃;溶剂延迟时间:5 min;质谱扫描范围:35～700m/z。

1.3.2 甲酯化前处理及分析

精密称取200 mg油样品,加入2 mL 2 mol/L KOH-CH3OH,10 mL正庚烷,在漩涡震荡仪上以1 500 r/min震荡2 min,静置分层,取上清液用0.22 μm微孔过滤器过滤;样品溶液待GC-MS进样分析。同时取C10～C40偶数碳正构烷烃混标适量,待GC-MS检测。

GC条件:石英毛细管色谱柱Rtx-5MS色谱柱(30 m×250 μm,0.25 μm);载气:氦气(纯度为99.99%);载气流速:0.76 mL/min;载气压力:57.4 kPa;进样口温度:270 ℃;温度程序为:初始温度120 ℃,2 min;120～220 ℃,10 ℃/min;220～224 ℃,1 ℃/min;224～258 ℃,10 ℃/min;258～282 ℃,3 ℃/min;282～300 ℃,1 ℃/min,10 min;进样量:1 μL;分流比:40∶1。

MS条件:电子电离源:70 eV;离子源温度:200 ℃;接口温度:280 ℃;溶剂延迟时间:5 min;质谱扫描范围:35～700m/z。

两种处理方式均在全扫描(Scan)检测模式下进行样品分析,记录总离子流图。大多数成分根据Vanden Dool 和Kratz线性程序升温原理的保留指数原理,利用公式求得各成分的保留指数(retention index)并与NIST 17质谱库中检索得到的保留指数进行比对,从而对油成分进行定性分析,最后通过峰面积归一法计算各组分的相对含量。

1.4 LC-MS分析

精密称取10 mg山银花油,加500 μL甲醇,在漩涡震荡仪上震荡1 min,冰水浴超声1 h,-40 ℃静置1 h后将样本4 ℃,12 000 r/min离心15 min,取上清液待LC-MS进样分析检测。

LC条件:色谱柱为BEH C18色谱柱(1.7 μm×2.1×100 mm);流动相:0.1%甲酸乙腈溶液(A)0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0～3.5 min,95%～85% B;3.5～6min,85%～70% B;6～6.5min,70% B;6.5～12 min,70%～30% B;12～12.5 min,30% B;12.5～18 min,30%～0% B;18～25 min,0% B;25～26 min,0%～95% B;26～30 min,95% B);流速0.4 mL/min,进样体积5 μL。

MS条件:扫描质量范围为m/z100～1 500,鞘气流速45 Arb,辅助气流速15 Arb,毛细管温度400 ℃,Full MS分辨率:70 000,MS/MS分辨率:17 500,在NCE模式下,轰击能量:15/ 30/ 45 eV,喷射电压:4.0 kV(正离子模式)或-3.6 kV(负离子模式)。

Q Exactive Focus 质谱仪能够在控制软件(Xcalibur,Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。将获得的质谱原始数据转换成mzML格式,再对保留时间的峰矫正和峰积分、峰识别、峰对齐等提取工作,基于自建数据库MWDB(Metware Database)及代谢物信息公共数据库对物质进行筛选和鉴定。

1.5 抗氧化活性的测定

1.5.1 ABTS自由基清除

按照试剂盒操作说明,并在参考文献[8]的方法上稍作修改,将山银花油溶液配制成浓度为(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)的供试品溶液,其他溶液按照试剂盒操作说明。在96孔板样品检测孔内加入各浓度样品10 μL/孔再加入ABTS工作液200 μL/孔,平行3份;样品空白孔加入各浓度样品10 μL/孔再加入工作液溶剂80%乙醇200 μL/孔;空白对照孔中加入DMSO10 μL/孔和80%乙醇200 μL/孔。阳性对照孔加入标准品溶液10 μL/孔和80%乙醇200 μL/孔;轻轻混匀,室温孵育6 min后测定其在405 nm处吸光度;以Trolox为阳性对照。样品抗氧化结果以Trolox当量(mmoL/g)表示。

1.5.2 DPPH自由基清除

在参考文献[9,10]的方法上稍作修改,用DMSO试剂配制DPPH成0.1 mg/mL的溶液,并配制成不同浓度的山银花油溶液(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、9.0 mg/mL),分别将不同浓度的山银花溶液与DPPH溶液按1∶1(100 μL∶100 μL)比例加至96孔板中,避光反应30 min,测吸光度A1(515 nm)。用等体积DMSO分别替代DPPH溶液和山银花油溶液,测得的吸光度分别为A2和A0。每份样品平行操作3次,取算术平均值,计算半数抑制率IC50值。按公式(1)计算清除率。

清除率=[1-(A1-A2)/A0] ×100%

(1)

1.6 抗炎实验

1.6.1 细胞培养及分组

将RAW 264.7细胞用含有10%的胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM完全培养基培养,放于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中。实验分为:空白对照组;DMSO组(0.2%);模型组(1 μg/mL LPS);DXMS组(50 μg/mL);山银花油低、中、高剂量组(30、40、50 μg/mL);不同药物浓度及溶剂组孵育2 h后,再加入终浓度为1 μg/mL的LPS,继续培养。

1.6.2 RAW 264.7细胞毒性实验

将细胞分为两组种板操作同上述,山银花组各孔加入含有不同浓度(0、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL)山银花油完全培养液100 μL,第一组不加LPS处理,第二组孵育2 h 后加入终浓度为1 μg/mL的LPS,空白组与溶剂组加入等体积溶剂。药物每组4个复孔,培养24 h后,吸去上清,每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL),继续培养4 h,弃培养液,加入150 μL DMSO,震荡、混匀10 min后于酶标仪490 nm波长下测吸光度,分别计算两组细胞的存活率。

1.6.3 炎症因子IL-6、NO含量检测

上清液收集:取小鼠RAW 264.7巨噬细胞接种于48孔培养板中,细胞密度为2×104个/mL,每孔200 μL,37 ℃,5% CO2条件下培养过夜后,弃培养液,加入无血清DMEM培养基同步化24 h。山银花油低、中、高剂量完全培养液200 μL,设置4个复孔;阳性药物组加入50 μg/mL DXMS,除空白对照组外其余各组孵育2 h后加入200 μL LPS使得终浓度为1 μg/mL;空白组加入等体积无血DMEM。孵育24 h后收集各孔上清液3 000 r/min离心10 min,吸取上清液,用于炎症因子检测。

炎症因子测定:按照ELISA与Griess试剂盒说明书操作检测细胞培养液中IL-6、NO的含量,每组设置4个复孔,根据标准曲线计算各组浓度。

1.7 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析山银花油的化学成分

采用超临界CO2萃取法提取山银花油,其得率为1.75%。GC-MS结果显示,山银花油通过非甲酯化(见图1A)和甲酯化(见图1B)分别鉴定出29和39种化合物。其中,非甲酯化处理得到的化合物占总油的51.91% (见表 1)。主要成分为γ-谷甾醇(8.12%)、角鲨烷(7.28%)、天然维生素 E(2.87%)、豆甾醇(2.41%)和2-单棕榈酸甘油(1.99%)等。由于沸点比较高,不容易气化及分离的物质在甲酯化后更容易被鉴别,通过甲酯化鉴定的化合物占总油的75.88%(见表1)。主要成分包括油酸乙酯(18.92%)、棕榈酸甲酯(7.78%)、角鲨烷(6.29%)、γ-谷甾醇(5.98%)和亚油酸甲酯(5.76%)等。

表1 山银花油GC-MS化学成分

图1 非甲酯化处理(A)和甲酯化处理(B)的山银花油GC-MS离子流图Fig.1 GC-MS ion flow diagrams of non-methyl esterified (A) and methyl esterified (B) Lonicerae Flos oil 注:(A)1:2-单棕榈酸甘油;2:角鲨烷;3:维生素E;4 :豆甾醇;5:γ-谷甾醇 ;(B)1:棕榈酸甲酯;2:亚油酸甲酯;3:油酸乙酯;4:角鲨烷;5:γ-谷甾醇。Note:(A) 1:2-Palmitoylglycerol;2:Squalene;3:Vitamin E;4:Stigmasterol;5:γ- Sitosterol;(B) 1:Methyl palmitate;2:Methyl linoleate;3:Ethyl oleate;4:Squalene;5:γ- Sitosterol.

2.2 LC-MS分析山银花油的化学成分

为了进一步研究油中的化学成分,用UHPLC-QE-MS对山银花油中化学成分进行分析。山银花油在正离子模式下的离子流图见图2A,根据提供的准确分子质量和数据库提供的信息匹配后检测到83个化合物(见表2),其中包括37个萜类、9个香豆素及其衍生物类、6个苯丙素类、5个生物碱类、4个黄酮类等(见图3A)14类化合物。在负离子模式下的离子流图见图2B,根据提供的准确分子质量和数据库提供的信息匹配后检测到71个化合物(见表3),其中包括21个萜类、12个黄酮类、7个脂肪酸类、7个酚类、5个苯丙素类等(见图3B)16类化合物。

表2 UHPLC-QE-MS正离子模式山银花油成分分析

表3 UHPLC-QE-MS负离子模式山银花油成分分析

图2 山银花油UHPLC-QE-MS正离子(A)和负离子(B)模式离子流图Fig.2 UHPLC-QE-MS ion flow diagrams of Lonicerae Flos oil in the positive (A) and negative (B) ion mode 注:(A)1:柚皮素;2:熊果酮酸;3:维生素D2;(B)1:柚皮苷;2:巴西苏木素;3:阿魏酸。Note:(A) 1:Naringenin;2:Ursolic acid;3:Vitamin D2;(B) 1:Naringin;2:Brazilin;3:Ferulic acid.

图3 UHPLC-QE-MS正负离子模式山银花油全成分分类统计图Fig.3 UHPLC-QE-MS full component classification statistical chart of Lonicerae Flos oil in the positive and negative ion mode 注:a:萜类;b:黄酮类;c:香豆素及其衍生物类;d:酚类;e:苯丙素类;f:脂肪酸类;g:其他类;h:脂肪酰类;i:生物碱;j:氨基酸衍生物;k:酚醚类;l:酚酸类;m:有机酸及其衍生物;n:木脂素类;o:糖类多酮类;p:酯类;q:糖类及其衍生物;r:糖苷类。Note:a:Terpenoids;b:Flavonoids;c:Coumarins and derivatives;d:Phenols;e:Phenylpropanoids;f:Fatty acids;g:Others;h:Fatty Acyls;i:Alkaloids;j:Amino acid derivatives;k:Phenol ethers;l:Phenolic acids;m:Organic acids and derivatives;n:Lignans;o:Phenylpropanoids and polyketides;p:Esters;q:Carbohydrates and derivatives;r:Glycosides.

2.3 抗氧化活性

山银花油样品清除ABTS自由基能力的结果以Trolox当量(mmol/g)表示。结果可得(见图4A),山银花油对ABTS的抗氧化能力存在一定的剂量关系,随着油浓度的增加,Trolox当量值越小,表明其抗氧化能力越强。同样的,山银花油清除DPPH自由基能力的结果与ABTS具有较好的一致性,呈现一定的剂量依赖性,结果可得(见图4B),其IC50值为3.49 mg/mL。

图4 山银花油对 ABTS(A)和DPPH(B)自由基清除能力Fig.4 The scavenging ability of Lonicerae Flos oil on ABTS (A) and DPPH (B) free radicals

2.4 抗炎活性

2.4.1 MTT法测定药物对RAW 264.7细胞活性影响

山银花油对RAW 264.7细胞活力的影响见图5,与正常组比较,DMSO溶剂组的细胞存活率无显著性差异(P<0.05),可知0.2%的DMSO溶剂在提高药物溶解度的同时对细胞无毒性,药物浓度在70～80 μg/mL的时候对细胞有一定的毒性,在60 μg/mL及以下浓度时,给药浓度在安全范围内,可以用于对细胞实验进行研究。

图5 山银花油对RAW 264.7细胞活性影响Fig.5 Effect of Lonicerae Flos oil on the activity of RAW264.7 cells注:与对照组比较,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,*P <0.05,**P <0.01.

2.4.2 MTT法测定药物对LPS诱导的RAW 264.7细胞活性影响

为了确保实验过程中药物溶液对于LPS引起的炎症反应作用不是由于其对细胞的毒性作用所致,研究采用MTT检测不同浓度药物对细胞的存活率的影响。山银花油对LPS诱导的RAW 264.7细胞活力的影响见图6,实验结果显示,1 μg/mL的LPS会促进细胞增殖,给药后细胞增殖均受到不同的抑制,但20～60 μg/mL仍然是安全浓度范围,可用于后续炎症因子测定实验。

图6 山银花油对LPS诱导RAW 264.7细胞活性影响Fig.6 Effect of Lonicerae Flos oil on the activity of LPS-induced RAW 264.7 cells注:与对照组比较,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,*P <0.05,**P <0.01.

2.4.3 药物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO和IL-6分泌的影响

Griess法和ELISA检测山银花油对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清液中NO和IL-6含量的影响见图7图8,巨噬细胞经LPS刺激24 h后大量分泌NO和IL-6,与对照组相比,模型组的NO和IL-6释放量极显著升高(P<0.01)。与模型组相比,山银花油高、中、低剂量组均能显著抑制NO和IL-6的释放量(P<0.01),且随着药物剂量的增加,抑制率也相应增加,均在高剂量组显示出最佳的抑制结果,表明山银花油都可显著抑制炎性因子释放且呈现剂量依赖性。

图7 山银花油对LPS刺激RAW 264.7细胞NO分泌的影响Fig.7 Effect of Lonicerae Flos oil on NO secretion in LPS-stimulated RAW 264.7 cell注:与对照组比较,#P <0.05,##P <0.01;与模型组比较,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,#P < 0.05,##P <0.01;Compared with model,*P <0.05,**P <0.01.

图8 山银花油对LPS刺激RAW 264.7细胞IL-6分泌的影响Fig.8 Effect of Lonicerae Flos oil on IL-6 secretion in LPS stimulated RAW 264.7 cells注:与对照组比较,#P <0.05,##P <0.01;与模型组比较,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,#P < 0.05,##P <0.01;Compared with model,*P <0.05,**P <0.01.

3 讨论与结论

本研究通过脂多糖(LPS)诱导的细胞炎症模型对山银花油进行体外抗炎和抗氧化活性评价,并基于GC-MS和UHPLC-QE-MS对山银花油进行全成分分析。本文中山银花油的提取采用了溶剂溶解性好,提取温度低,安全性极大,并能有效的预防药材中活性成分的氧化分解的超临界CO2萃取法[11]。通过GC-MS分析可知山银花油共鉴别出66种化合物,主要为脂肪酸类(棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯等)、甾醇类(γ-谷甾醇、豆甾醇、等)及烷烃类(角鲨烷、正二十四烷等)化合物。研究表明,亚油酸等多不饱和脂肪酸能够抑制引起炎症的介质和细胞因子的致炎作用,缓解急性和慢性炎症相关疾病[12];豆甾醇等甾醇类化合物可有效地延缓油脂脂质过氧化反应,抑制油脂酸价和过氧化值的升高,其抗氧化作用明显优于二丁基羟基甲苯 (BHT)和维生素C[13]。通过UHPLC-QE-MS在正负离子模式下分别鉴别出142和83种化合物,主要有萜类、香豆素及其衍生物类、苯丙素类、生物碱类、黄酮类等化合物。据文献报道,维生素D2、熊果酮酸等萜类化合物能减少体内及体外的IL-6、TNF-α的表达发挥抗炎作用,且有显著的体外抗氧化能力[14-16]。柚皮素、巴西苏木素等黄酮类化合物能抑LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO、PGE2、TNF-α等炎症因子的释放,并能发挥抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[17,18]。阿魏酸等苯丙素类化合物有研究表明能有效清除过氧化氢、过氧化亚硝基、超氧自由基[19]。因此,从以上结果可以推测山银花油具有抗氧化和抗炎等活性。

Zeng等[20]通过金银花和山银花提取物均能显著抑制二甲苯所致小鼠的耳廓肿胀程度及在体外细胞模型中可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症因子的释放,都具有良好的体内外抗炎作用。Zou等[21]采用LPS诱导的细胞炎症模型对山银花不同萃取部位进行体外抗炎活性评价,山银花不同萃取部位均有不同程度的抗炎活性。本研究采用LPS诱导的细胞炎症模型评价了山银花油的抗炎活性,表明山银花油具有显著的抗炎活性并呈现剂量依赖,与前人研究具有相似的结论。

事实上,抗炎实验表明山银花油能显著抑制炎性因子的释放,表现出抗炎作用。以上结果说明,山银花油是一种具有较好抗炎作用的天然活性物质,具有较好的开发和应用价值。本研究的抗氧化结果表明山银花油清除ABTS及DPPH自由基的能力不强,可能是由于本方法提取的油中的抗氧化物质含量太低的原因,也提示我们可以进一步开发新的提取方法。因此,本研究的全面化学分析结果及初步活性评价可为山银花在药食两用的全面开发提供基础。