海洋真菌Aspergillus jensenii SS5中化学成分研究

胡靖瑶,袁瑞瑛*,王广明,蔡诗琪,周明琦,王富乾,蔡由生

1西藏大学医学院,拉萨 850012;2武汉大学药学院,武汉 430071;3武汉市第一医院药学部,武汉 430022

海洋是地球上最大的表面资源,其中存在着巨大的生物多样性,是天然产物的重要来源之一。尤其是其中多种多样的海洋微生物,在很大程度上还未被开发。海洋真菌在极端的生存环境下,有着独特的代谢方式与途径,生存繁殖方式、适应机制,从而产生结构新颖、具有多种生物活性的次级代谢产物,引起国内外科学家的密切关注[1,2],成为当前最具开发前景的海洋天然产物新药源,也是研发新型先导化合物的热点之一[3]。

曲霉属广泛分布于陆地和海洋环境中,海洋曲霉已证实具有产生大量结构多样次级代谢物的能力。1992年Numata等[4]报道了首个海洋曲霉来源的天然产物,揭开了海洋曲霉次级代谢产物研究的篇章。截至2018年,研究报道的海洋曲霉来源的新天然产物数量已经超过了979个,包括聚酮类、生物碱类、萜类、大环内酯、酰胺类、甾体类、卤代物类、肽类等多种类型,这一系列海洋真菌次级代谢产物具有抗肿瘤、抗病毒、清除自由基、抗氧化、神经保护、抗炎、抗心脑血管等疾病、抑菌和抗虫等多种生物活性[5,6]。例如,从海洋真菌Aspergillusniger发酵产物中提取得到了化合物aurasperone H,对人急性早幼粒白血病细胞HL-60具有显著的细胞毒性[7]。海洋真菌AspergillusjenseniiLW128发酵粗提取物中获得的二苯醚类化合物diorcinol D具有良好的抗菌活性[8]。有必要进一步对罕见的海洋曲霉属真菌进行深入研究,充分发掘其生物合成潜力,以获得更多可以开发为前体药物的天然产物。因此本实验以一种从中国南海海洋沉积物中分离获得海洋真菌AspergillusjenseniiSS5为研究对象,对其发酵产物进行化学成分鉴定,以期获得具有显著细胞毒活性的次级代谢产物,为小分子癌症治疗药物设计提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Bruker AVANCE400和600超导核磁共振仪;LC3000高效液相色谱仪(瑞亿斯公司);SB-2000旋转蒸发仪器(上海艾朗仪器有限公司)。提取分离所用分析纯试剂丙酮、醋酸乙酯、甲醇、石油醚等(湖北申试化工科技有限公司);色谱级甲醇(湖北弗顿科学技术有限公司)。人肺癌A549和人肝癌Bel-7402均购自美国模式培养物集存库(ATCC);5-氟尿嘧啶(5-FU)(纯度≥99%,批号F6627,Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司)。

1.2 菌种来源

本实验所使用的真菌菌株是从中国南海海洋沉积物中分离获得,编号SS5,菌株由武汉大学药学院洪葵教授课题组鉴定。根据测序结果构建系统发育树,菌株SS5与AspergillusjenseniiNRRL 58600亲缘关系最近,比对结果中其序列相似度为99.28%,结合形态学分析,初步判断菌株SS5为曲霉属真菌A.jensenii。

1.3 菌种的发酵与分离提取

将26℃下静置培养30 d后的液体发酵的菌丝体破碎,丙酮超声提取3次,每次20 min,浓缩提取液,和培养液混合,浓缩后用醋酸乙酯萃取3次,浓缩得到浸膏(32.0 g)。浸膏经正相硅胶柱色谱分离,石油醚-醋酸乙酯(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脱,得到9个部分A～I。组分B(1.5 g)用正相硅胶柱色谱分离,石油醚-醋酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脱后,得到4组分B1～B4。B3(298 mg)组分进一步采用Sephadex LH-20柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)分离,得到7个组分B3a～B3g。B3d(34 mg)通过半制备HPLC分离纯化(60%甲醇,体积流量3 mL/min,254 nm),得到化合物1(6 mg,tR= 15.6 min)、2(8 mg,tR= 26.1 min)。组分E(3.1 g)经正相硅胶柱色谱分离,用二氯甲烷-甲醇(50∶1→1∶1)梯度洗脱后,得到6个组分,即E1～E6。E2(184 mg)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离得到E2a(31 mg)、E2b(22 mg)、E2c(39 mg)、E2d(19 mg)、E2e(61 mg)。E2b经半制备HPLC分离(40%～80%甲醇,体积流量3 mL/min,254 nm)得到化合物3(6 mg,tR= 15.3 min)。G部分(8.3 g)经Sephadex LH-20柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)分离,得到7个组分G1～G7。G1(135 mg)经正相硅胶柱色谱分离,用石油醚-醋酸乙酯(10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脱后,得到6个组分G1a～G1f。G1c(15 mg)经半制备型HPLC分离(55%甲醇,体积流量3 mL/min,254 nm)得到化合物4(2 mg,tR=25.6 min)。

1.4 化合物活性测试

采用SRB法[9],测试了化合物1～4化合物对人肺癌A549和人肝癌Bel-7402两种细胞的生长抑制作用,5-氟尿嘧啶(5-FU)为阳性对照,选用对数生长期细胞,胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×104个细胞/mL,按照每孔190 μL细胞悬液接种在96孔培养板中,37 ℃、5%CO2培养24 h。药物处理孔加入10 μL样品溶液(终质量浓度化合物为5 μg/mL,混合物为50 μg/mL),阳性药物孔加入终质量浓度为5 μg/mL的5-FU进行处理;对照孔加入含等体积溶媒的培养基,37 ℃,5% CO2培养3 d。弃去培养基,加入100 μL 4 ℃预冷的50% 三氯乙酸(TCA)固定细胞。先静置5 min,然后再移至4 ℃放置1 h。倒掉固定液,蒸馏水洗涤5次去除TCA,空气干燥1 h。每孔加入0.4% SRB溶液80 μL,室温染色30 min。弃染液,1% 醋酸洗涤5次充分去除未结合的SRB,空气干燥。加入150 μL 10 mmol/L Tris-base(pH 10.5)溶解,微型振荡器上振荡5 min。M5酶标仪测定OD510 nm值。根据公式:肿瘤细胞生长抑制率=(OD对照-OD药物)/(OD对照-OD空白)×100%计算各化合物的细胞抑制率。

2 结果

2.1 结构鉴定

图1 化合物1的X射线晶体结构Fig.1 X-ray crystal structure of compound 1

化合物1～4的化学结构如图2。

图2 化合物1～4的化学结构Fig.2 Chemical structures of compounds 1-4

2.2 肿瘤细胞毒活性

活性测试结果表明(见表1),海洋真菌A.jenseniiSS5中的化合物4对A549人肺癌细胞株和Bel-7402人肝癌细胞株均有较好的抑制作用,在5 μg/mL浓度下,初筛抑制率分别为41.23%、42.23%(阳性对照5-氟尿嘧啶对两株肿瘤细胞抑制率分别为47.45%、72.99%);化合物2对A549人肺癌细胞株的初筛抑制率为47.34%。化合物1和3在初筛浓度下对这两种细胞无明显细胞毒活性。

表1 化合物1～4的癌细胞生长抑制活性

3 讨论与结论

从海洋真菌A.jenseniiSS5的粗提取物中分离得到四个化合物:epigriseofulvin(1)、sterigmatocystin(2)、brevianamide M(3)、meleagrin(4),其中化合物1～3是首次从海洋A.jensenii中分离得到,极大地丰富了曲霉属真菌A.jensenii次生代谢产物结构的多样性。大量的研究结果已经证明,海洋曲霉属真菌是多种具有丰富生物活性的次级代谢产物的重要来源,许多海洋曲霉来源的新天然产物具有较好的抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性,因此本文对4种化合物的细胞毒性进行了测试,结果表明化合物4可以有效抑制人肺癌A549细胞和人肝癌Bel-7402细胞,化合物2对A549人肺癌细胞株有较好抑制作用,这两种化合物有望作为抗癌前体药物进行深入研究,本研究也为天然活性化合物的开发提供了一定的理论依据。