NLRP3炎症小体在不孕不育相关生殖疾病中的作用研究进展

冯蕾，马昕芮，张凌云

(郑州大学第一附属医院生殖与遗传专科医院,郑州 450052)

2002年Martinon等[1]初次提出了炎症小体(inflammasome)这一定义,炎症小体能有效介导炎症介质激活,是体内免疫系统的关键调节物质。其主要功能是参与半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的激活,诱导产生尚不具有生物活性的白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和白细胞介素18前体(pro-IL-18),并对其进行加工使之成为具有生物活性的炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)并促使其分泌,从而诱导炎症反应。NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的激活涉及许多免疫和代谢紊乱疾病,例如慢性炎症、炎症性肠病、痛风、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖等。近些年来,关于炎症小体的研究已经拓展至生殖领域,其研究内容涵盖了女性和男性不孕不育的多种疾病,如多囊卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症(EMs)、卵巢早衰(POF)、复发性流产(RSA)以及男性精子发生障碍等[2-6]。目前研究最深入的是NLRP3炎症小体,调控NLRP3炎症小体的产生与激活有可能成为生殖相关疾病治疗的新方向。因此,本文综述了NLRP3炎症小体在生殖医学领域不孕不育相关疾病中的作用及机制研究,以期为不孕不育相关疾病的治疗提出新的思路和启发。

一、NLRP3炎症小体的组装与活化

NLRP3炎症小体是由结合分子(NLRP3)、衔接分子[包含胱天蛋白酶募集域蛋白(CARD)的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)]以及效应分子(caspase-1)组成的一种多聚蛋白质复合体[7],3种组成蛋白质之间相互作用严格调节炎症小体的功能,进而调控炎症和免疫反应,使NLRP3炎症小体在机体的固有免疫和炎症相关疾病发生过程中发挥重要作用[8]。

NLRP3(又称NALP3或cryopyrin)作为一种细胞内受体,可以通过感知外来病原体或者自我危险信号导致NLRP3炎症小体的形成和激活。NLRP3炎症小体具有非常广泛的激活物,但不同激活物诱导NLRP3活化的机制并不相同,主要有两种激活模式:病原相关分子模式(PAMPs),损伤相关分子模式(DAMPs)[9]。人体的固有免疫系统借助模式识别受体(PRRs)识别PAMPs和DAPMs,目前为止共发现了3类PRRs:RIG-I样受体(RLRs)、NOD样受体(NLRs)、Toll样受体(TLRs)[10]。在大多数类型的细胞中,激活NLRP3炎症小体需要经历两个步骤和两种信号:第一信号是启动信号,这是NLRP3炎症小体活化的前提步骤,在该步骤中TLRs识别外来危险信号,诱导核因子Kappa B(NF-κB)介导的信号传导通路的激活,能够上调pro-IL-1β及NLRP3在大多数细胞中的表达水平[11-13],并且该信号激活NLRP3的转录后加工修饰,使之在第一信号处理后以高反应状态迎接第二信号;第二信号即激动信号,通过PAMPs和DAMPs启动接头蛋白ASC和效应蛋白pro-caspase-1组成复合体蛋白质,进而活化NLRP3炎症小体,此步骤促使pro-caspase-1剪切为caspase-1,引起成熟IL-1β和IL-18炎症因子的产生与分泌[11,14]。此外,K+外流也是促使NLRP3炎症小体激活的重要因素[15]。

NLRP3炎症小体的激活物种类繁多,而不同种类的激活物对NLRP3炎症小体的活化作用机理也各不相同。当前仍然需要进一步的研究工作了解NLRP3炎症小体激活的精细机制以及各激活通路中多种信号的整合方式。

二、NLRP3炎症小体与生殖疾病

(一)NLRP3炎症小体与PCOS

PCOS是一种内分泌和代谢紊乱性疾病。PCOS作为一种常发于育龄期女性的异质性疾病,在临床上常表现为闭经、不孕、多毛、痤疮和肥胖等,且多伴有代谢异常,如高胰岛素血症、高脂血症和胰岛素抵抗(IR),其特点包括慢性无排卵、生化和/或临床高雄激素血症、卵巢形态呈现多囊样改变等。

PCOS也是一种慢性低度炎症性疾病,患者的外周血及卵泡液中炎症介质水平均有升高[16]。炎症因子可导致卵巢组织重建,改变卵泡的正常发育[17]。此外,PCOS患者卵巢组织中的淋巴细胞和巨噬细胞较正常人群有一定程度的升高,并且分泌出大量细胞因子激活NF-κB信号通路,致使颗粒细胞过早凋亡,使优势卵泡的形成受到抑制[18]。

1.PCOS与高雄激素血症:高雄激素血症是PCOS不孕的主要原因,长期持续的高雄激素可导致卵泡发育障碍[19]。伴有IR的PCOS患者胰岛素分泌增加,通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)的负反馈以及对性激素结合球蛋白(SHBG)合成的抑制,最终将导致卵泡膜细胞合成和分泌的雄激素水平升高[20]。通过雄激素-受体和雄激素-雌二醇-受体两条信号通路协同作用,高雄激素促使卵泡内C型钠肽/钠肽受体(CNP/NPRs)异常高表达,继而抑制促性腺激素调控的卵母细胞成熟和排卵进程,最终导致排卵障碍这一结局的产生[21]。此外,高雄激素也能通过激活NLRP3炎症小体,诱发卵巢慢性低度炎症,加重PCOS患者的炎症反应,进一步导致包括卵巢颗粒细胞嗜酸性死亡、卵泡功能障碍和卵巢间质细胞纤维化在内的一系列病理学现象[19]。

2.PCOS与IR:IR也是导致PCOS患者慢性炎症出现的原因之一[22-23]。据统计,有半数以上的PCOS患者存在IR,且伴有IR的PCOS患者体内炎症因子水平更高,这在一定程度上提示IR可能与PCOS慢性炎症的产生相关联[24]。而PCOS的炎症也将促进IR的进一步发展:超量的炎症因子破坏PCOS患者体内活性氧自由基(ROS)的平衡状态,导致过多的ROS通过促进细胞内一氧化氮(NO)的产生而加速胰岛β细胞的凋亡;过多的ROS致使葡萄糖转运、脂肪合成及胰岛素信号转导均受到抑制;此外,过多的ROS促进脂肪分解加速导致循环中脂肪酸水平升高[25]。

3.PCOS与肥胖:30%～60%的PCOS患者为肥胖型,巨噬细胞在肥胖状态下浸润增加转变为促炎表型,激活NLRP3炎症小体,诱导脂肪组织中IL-1β和IL-18成熟和分泌,因此肥胖PCOS患者的炎症因子表达水平往往更高[22]。大量蓄积的脂肪组织可以通过分泌脂肪因子激活NF-κB信号通路,促进炎症反应的发生,同时影响机体的脂类代谢[26]。此外,通过对信号转导和转录激活子3(STAT3)信号通路的调节,炎症因子还可以诱导脂肪细胞增殖,促进脂肪酸的释放[27]。而PCOS患者卵泡液中脂肪酸升高(尤其是油酸)可以通过上调炎症因子表达影响颗粒细胞的炎症反应,并且可能成为卵母细胞受损的一个重要因素[28]。

4.PCOS与MicroRNA:MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一种短链、非编码、具有转录后调控功能的单链小分子RNA,能通过抑制转移或促进靶mRNA的降解,对细胞的增殖和凋亡程序进行调节[29]。近年来在PCOS患者的卵泡液中发现了越来越多异常表达的miRNA[30],尤其在PCOS小鼠模型的卵巢组织中miR-1224-5p的相对表达大幅下调,经研究发现,miR-1224-5p可通过负调节叉头框蛋白O1(FOXO1)的表达抑制NLRP3炎症小体和NF-κB通路激活,并能够在肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理后的人卵巢颗粒细胞瘤细胞(KGN)中发挥抗炎作用[31],这提示miR-1224-5p可能是未来治疗PCOS的新方向。

目前,慢性炎症反应被认为是PCOS发病的主要原因,但其分子机制尚未明确。当前已有大量的研究强调IR、肥胖及高雄激素血症在PCOS患者慢性炎症反应增加过程中存在相互作用,这些反应状态可能对PCOS发生发展有影响[32]。因此探索NLRP3炎症小体在PCOS发病机制中的作用或许会为PCOS预防和治疗带来新思路。

(二)NLRP3炎症小体与EMs

EMs是目前临床治疗中的挑战性问题,其临床表现广泛,主要包括功能失调性子宫出血、非周期性下腹疼痛等,最常见的症状是进行性加重的经期疼痛、性交困难、盆腔疼痛和不孕。EMs是一种伴有慢性炎症的雌激素依赖型疾病。当前,EMs发病机制的探索主要集中在炎症免疫与性激素变化上[33-34]。

目前研究认为,逆行月经是异位子宫内膜组织的源头,而EMs患者体内的炎症反应是EMs进一步发展的关键因素[35]。EMs不孕的原因主要有3个方面:解剖结构扭曲改变、排卵功能障碍、微生态炎症相关的腹膜或着床损伤,这些致病性的变化与性激素信号传导改变相关;有研究报道活性雌激素可以加重EMs相关的病理反应和临床表现,如炎症反应和临床疼痛等[36-37]。EMs患者往往存在雌激素受体表达紊乱,表现出雌激素依赖以及孕激素抵抗的现象,而炎症反应与这一现象的出现密切相关[38-39]。雌激素介导的细胞信号改变在EMs发病机制中有着至关重要的作用,雌激素的生理作用是由雌二醇(E2)和雌激素受体ERα、ERβ结合完成的,两种受体类型在EMs组织中均表达,两者可共同促进EMs病变中增殖、黏附、炎症信号的调节,但两者功能侧重不同[40]。经研究发现,在EMs小鼠的原位子宫内膜和异位内膜组织中ERβ的水平较高,并且ERβ可与NLRP3相互作用并通过激活caspase-1增强炎症小体的活性;此外,ERβ过表达的子宫内膜间质细胞蜕膜化反应受抑制,这一表现增加了与EMs相关不孕症的发生,研究人员推测这可能与NLRP3炎症小体有关,但尚缺少进一步研究[40]。

近年来有579个参与人类炎症和免疫的基因和15个管家基因被证实与EMs患者的炎症和免疫反应相关,其中,396个与编码caspase-1、IL-18和NLRP3通路相关的基因在异位子宫内膜组织样本中存在过表达,这提示EMs的出现与异常炎症小体的活化密切相关[34]。EMs小鼠模型的临床前研究显示,EMs组中炎性细胞浸润、NLRP3炎症小体形成(caspase-1、NLRP3、ASC表达上调)及炎性介质(IL-1β、TNF-α)水平升高与星形胶质细胞升高基因-1(AEG-1)表达上调相关,该基因的过表达可以通过降低细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)促进EMs患者细胞中的NLRP3炎症小体激活,进而导致下游炎症反应的发生[5]。单独沉默AEG-1基因可以升高SOCS1表达水平进而抑制NLRP3炎症小体激活[5]。此外,NLRP3炎症小体可以与E3泛素连接酶(TRIM24)结合,TRIM24缺乏时NLRP3炎症小体激活增加[41]。近年来有研究发现雌激素是肥大细胞中NLRP3炎症小体的主要激活剂,可以促进EMs的发生,而使用NLRP3抑制剂CY-09和MCC950在特异性抑制子宫NLRP3表达的同时抑制肥大细胞中IL-1β的产生,减少EMs小鼠实验模型中的子宫内膜损伤,改善卵巢功能,并抑制卵巢颗粒细胞的氧化应激反应,这对EMs的发展和纤维化有保护作用[42-43]。Guo等[43]的研究还显示,Ⅲ～Ⅳ期EMs患者腹膜液中较高水平的IL-1β对NLRP3的表达上调和巨噬细胞的活化有促进作用。

子宫内膜异位囊肿基质细胞(ESCs)的自噬功能障碍可能是诱导NLRP3炎症小体相关IL-1β分泌的原因之一,而雌激素可激活NLRP3炎症小体并诱导正常的ESCs分泌IL-1β;此外,肥大细胞中NLRP3炎症小体通过雌激素信号级联的激活也参与了EMs的形成[39,43-44]。有研究指出高脂饮食可以通过增加巨噬细胞浸润和增加促炎和促氧化应激信号通路相关基因的表达诱导内膜异位病变,而NLRP3炎症小体在肥胖的低度炎症和IR中发挥关键作用,但是目前尚无直接证据证实NLRP3参与肥胖介导的EMs[45]。

目前已有多项研究表明,NLRP3炎症小体激活与EMs的发病机制密切相关,未来针对EMs发生发展中NLRP3炎症小体作用分子机制和调节通路以及靶向抑制NLRP3炎症小体信号通路展开进一步的研究,或将为EMs的预防和诊疗开拓新的研究方向。

(三)NLRP3炎症小体与POF

POF又称为早发性卵巢功能不全,是指40岁之前女性由于卵巢功能衰竭而出现继发性闭经、不孕症的现象,患者通常也会伴有低雌激素和高促性腺激素状态。目前已知的引起POF的病因可能有很多方面,如自身免疫性因素、染色体异常、促性腺激素受体异常以及医源性因素等。

POF患者的免疫调节及应答能力均处于衰退状态,近年来有研究发现POF小鼠卵巢组织中NLRP3、caspase-1、ASC水平均比正常对照小鼠显著升高[46]。NLRP3炎症小体与年龄依赖性的女性生育力丧失有关,抑制NLRP3炎症小体的产生和激活可以改善生殖系统衰老相关的激素及代谢变化,减少细胞凋亡,预防卵巢衰老,从而减轻雌性小鼠的生殖衰老现象,延长生育力[4]。

迷迭香酸(RA)在体外或体内对原发性卵泡衰竭均有保护作用,使用RA治疗POF小鼠不仅可以抑制卵巢NLRP3炎症小体的激活,降低炎症细胞因子IL-1β、IL-18的分泌,还能够调节卵巢凋亡相关蛋白的表达并改善POF小鼠黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等生殖激素的异常分泌[46]。艾灸作为传统中医疗法,其效用包括改善免疫功能、抑制氧化应激及细胞凋亡。目前有临床研究发现艾灸可以通过抑制NLRP3介导的细胞焦亡来减轻POF:一方面可以直接抑制TXNIP/NLRP3/caspase-1信号诱导的细胞焦亡;另一方面通过抑制TLR4/My88D/NF-κB信号通路间接降低NLRP3、pro-IL-1β及pro-IL-18 mRNA的表达[47]。因此,艾灸可能是一种新的POF治疗策略。此外,人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)通过miR-100-5p甲基化抑制NADPH氧化酶4(NOX4)/NLRP3信号通路减少细胞凋亡,改善POF,为POF的治疗提供了新的方向[48]。

目前已有研究证实NLRP3炎症小体与高龄女性生育能力下降有关,抑制NLRP3的激活可减轻这一生育能力衰退现象,但针对其在POF中的作用机制尚未有明确的研究报告发表。激素替代疗法是临床治疗POF相关症状最常用的方法,但该种疗法存在较多副作用。近年来中医药疗法以其高疗效、高安全性的特点在POF治疗中受到了广泛关注,研究也证实艾灸能够抑制NLRP3炎症小体激活通路。同时,人脐带间充质干细胞也被证实可以通过抑制NLRP3信号通路改善POF。因此进一步探究炎症小体在POF发生过程中的作用机制有望为预防和逆转POF带来新的突破。

三、总结与展望

综上所述,炎症小体是许多炎症反应的中心环节,在不孕不育相关的生殖领域中同样发挥着重要作用。NLRP3炎症小体通过NLRP3/ASC/caspase-1信号通路参与了多种炎症因子的成熟与分泌,与PCOS、EMs等多种生殖疾病的发生发展过程存在密切联系。

尽管NLRP3炎症小体的相关研究已经取得了重大突破,但仍有许多问题亟待解决:首先,NLRP3炎症小体的活化调控机制在不同的病理机制和激活刺激条件下表现为多样性,但其确切的机制尚不明确,探索NLRP3炎症小体的激活调控机制是当前研究的重点。其次,许多不孕不育相关的生殖疾病均存在一定程度的炎症反应,NLRP3炎症小体在这些疾病中扮演的重要角色已为人们所熟知,但对于NLRP3炎症小体是如何参与并调节疾病的发生和发展,以及其在这些疾病中的具体作用机理如何,也是后续需要不断探索的一个重要问题。最后,目前NLRP3炎症小体被认为是治疗许多炎症相关性疾病的可能靶点,在未来需要更多高质量的研究才能找到既安全又有针对性的治疗策略。