辅助生殖中反复种植失败的相关危险因素分析

胡巨伟，郑娟，孟珂，周黎明，李洁

(宁波市妇女儿童医院,宁波 315000)

辅助生殖技术为越来越多的不孕不育家庭带来了生育的希望,已经成为了最主要的助孕手段之一,但仍有约10%的患者在辅助生殖助孕过程中会发生反复种植失败(RIF)。根据中国医师协会生殖医学专业委员会的专家共识[1],RIF定义为:40岁以下成年女性在3个新鲜或冷冻周期内移植至少3枚优质胚胎后仍未能实现临床妊娠,其中优质胚胎包括第3天优质卵裂期胚胎(细胞数≥8个、卵裂球大小均匀、碎片率<10%)和优质囊胚(≥3BB)。RIF病因复杂多样,已成为影响辅助生殖助孕成功率的瓶颈之一。影响胚胎种植的因素繁多,涉及辅助生殖的整个流程,主要包括母胎界面免疫因素、生殖系统解剖结构异常、控制性促排卵方案的影响、胚胎因素以及黄体支持方案等。近年来,越来越多的研究将目光专注于这一领域。但是,大多数研究聚焦于解剖学结构异常、母胎界面的免疫紊乱以及基因异常等方面[2-3],而患者自身因素、体外受精-胚胎移植(IVF-ET) 过程及实验室指标对RIF的影响的研究鲜有报道。本研究通过回顾性分析522个RIF周期和935个正常妊娠周期患者自身因素及胚胎实验室指标,探索辅助生殖过程中发生RIF的危险因素,为RIF的病因筛查和临床治疗提供理论依据。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1月至2022年12月在宁波市妇女儿童医院生殖中心行IVF-ET助孕治疗的不孕不育患者的临床资料。根据移植次数和妊娠结局分为RIF周期组(RIF组)和正常妊娠周期组(对照组)。

RIF组纳入标准:女方年龄<40岁,在3个新鲜或冻融胚胎移植周期内移植至少3枚优质胚胎后仍未能实现临床妊娠,其中优质胚胎包括第3天优质卵裂期胚胎(细胞数≥8个、卵裂球大小均匀、碎片率<10%)和优质囊胚(≥3BB)。对照组纳入标准:女方年龄<40岁,一次新鲜胚胎移植周期即获得临床妊娠。

排除标准:有染色体异常患者;有严重的生殖道或宫腔畸形患者;行植入前遗传学检测(PGT)患者。

共纳入522个RIF周期和935个正常妊娠周期。本研究获得宁波市妇女儿童医院伦理委员会审批通过。

二、助孕过程回顾

根据患者的年龄、基础卵泡刺激素(FSH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、窦卵泡数(AFC)和既往促排卵周期的反应等综合考虑选择促排卵方案,个体化制定促性腺激素(Gn)启动剂量。Gn刺激4 d后开始卵泡监测,根据超声和血清性激素水平及时调整Gn剂量,当60%的主导卵泡直径达16～18 mm时,肌肉注射4 000～10 000 U人绒毛膜促性腺激素(HCG),36～37 h后在阴道超声引导下穿刺取卵。取卵4 h后行体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI),授精18～20 h后观察受精情况并记录。

取卵3 d或5 d后观察胚胎的生长情况并进行形态学评分。根据患者情况选择1～2枚优质胚胎移植,移植后给予黄体支持,HCG阳性者持续黄体支持至移植后60 d。胚胎移植14 d后检查血清HCG水平,血HCG >10 U/L诊断为HCG阳性,HCG阳性者于2周后B超检查是否宫内妊娠,见孕囊及胚芽者诊断为临床妊娠。

三、观察指标

患者一般资料,包括女方年龄、不孕年限、不孕类型、体质量指数(BMI)、基础AMH水平、HCG日子宫内膜厚度;促排卵相关资料,包括Gn天数、Gn总量、HCG日黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)水平以及HCG日卵泡数;胚胎实验室数据,包括获卵数、受精数、两原核(2PN)受精数、卵裂数、优胚数。

四、统计学分析

结 果

一、患者临床资料比较

本研究共纳入522个RIF周期(RIF组)和935个正常妊娠周期(对照组)。

1.一般临床资料比较:RIF组女方年龄、不孕年限和继发不孕比例均显著高于对照组(P<0.05),而基础AMH水平显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般临床资料比较[(-±s),M(P25,P75),n(%)］

2.促排卵及实验室相关资料比较:RIF组Gn天数、Gn总量、HCG日卵泡数、内膜厚度,以及获卵数、受精数、2PN数、卵裂数、优胚数均显著低于对照组(P<0.05),而HCG日LH、P水平均显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 患者促排卵及实验室资料比较[(-±s),M(P25,P75)］

二、RIF风险因素二元Logistic回归分析

将上述组间比较中具有统计学意义的指标纳入Logistic回归分析模型,去除中介变量后,分析显示:女方年龄、不孕年限、HCG日内膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天数为RIF的独立影响因素(表3)。HCG日内膜厚度和HCG日P水平对RIF影响较大:内膜厚度每增加1 mm,发生RIF的风险下降约40%;HCG注射日P值每增加1 nmol/L,发生RIF的风险增加约46.2%。

表3 二元Logistic回归分析RIF风险因素

三、ROC曲线评价Logistic预测模型

Logistic回归模型的模型系数综合检验显示模型具有统计学意义(χ2=370.614,P<0.001)。用ROC曲线评价二元Logistic回归预测模型[AUC=0.808,95%CI(0.783,0.833),P<0.001],提示我们所建立的预测模型效果较好(图1)。

图1 Logistic 回归预测模型的ROC曲线

讨 论

影响胚胎种植成功的关键因素有母体因素和胚胎因素,母体因素又包括一般危险因素、子宫内膜因素、宫腔因素、免疫因素以及内分泌因素等[4]。我们的研究通过比较RIF组和正常妊娠组患者在一般临床资料、促排卵过程及胚胎实验室数据资料方面的差异,寻找引发RIF的可能危险因素,而后又通过二元Logistic回归分析进行多因素分析,进一步控制混杂因素,探索RIF的独立影响因素。我们的研究显示,女方年龄、不孕年限、HCG日内膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天数为RIF的独立危险因素(P<0.05)。较全面地探索了辅助生殖助孕过程中个体因素、促排卵过程和胚胎实验室指标中可能导致RIF的危险因素,有助于及时有针对性地调整助孕策略,提高胚胎的种植率,得到良好的妊娠结局。

目前的研究多集中于宫腔环境对胚胎种植的影响,宫腔环境正常是胚胎种植的基本条件。多项研究表明,宫腔异常如子宫内膜增生、子宫内膜息肉、子宫粘膜下肌瘤、宫腔粘连等会影响胚胎种植[5-7]。但是,并非所有宫腔异常均会影响胚胎种植,明显占位或者位置不佳的肌瘤及息肉、深部浸润进而破坏生殖系统内环境的子宫内膜异位症、直接损害子宫内膜功能的子宫腺肌病以及严重输卵管积水倒灌宫腔才会对胚胎种植造成较为严重的不良影[8]。目前,宫腔镜检查被认为是宫腔内病变评估的金标准,在RIF的诊断和治疗中被广泛应用。多项研究表明,RIF患者在胚胎移植前行宫腔镜检查可显著提高新鲜和冻融胚胎移植周期的胚胎种植率[9-10]。

胚胎植入过程还涉及母胎界面的免疫调节,其中涉及多种免疫细胞及细胞因子的调控作用,是目前胚胎种植方面的研究热点。子宫内膜的蜕膜基质细胞能够调节滋养层细胞的侵袭并抑制局部母体免疫反应,对胚胎植入至关重要[1]。外周血或子宫内膜免疫细胞的异常也可能导致胚胎植入的失败,因此免疫调节紊乱也是导致RIF的重要因素。

年龄和不孕年限对胚胎的种植影响是多方面的,女性随着年龄的增长,体内激素水平下降,卵巢功能也随之下降,进而影响卵子的质量和胚胎的质量。石礼红等[11]的多因素回归模型分析发现女性年龄是不孕女性行IVF-ET治疗临床妊娠结局的独立危险因素,不同年龄组之间的临床妊娠率、流产率和活产率差异有统计学意义,≥40岁的高龄妇女获卵数、卵裂数、2PN数、优质胚胎数明显减少。同时,女性年龄还影响子宫内膜厚度,王瑜等[12]的研究显示随着女性年龄增加,子宫内膜厚度降低,临床妊娠率也显著降低。郭玲等[10]的研究也显示,RIF组患者的不孕年限显著高于对照组,回归分析显示,不孕年限是RIF的独立危险因素,我们的研究结论与其一致。

在合适的种植窗植入胚胎也是成功妊娠的关键[13]。种植窗期间子宫内膜容受性最高,子宫内膜由增值期转化为分泌期,表现为子宫内膜分子和组织学产生变化,如上皮细胞增殖抑制、上皮细胞重塑以及基质细胞发生蜕膜化等[14]。子宫内膜上皮细胞在胚胎植入过程中参与母-胚通讯,基质细胞发生蜕膜化转变为分泌细胞后,具有促进生长和发育的重要作用。发生这些变化的原因可能与子宫内膜转录组基因的差异表达有关[15-16],孕酮(P)和雌二醇(E2)是上述功能的主要调节因素,通过多种旁分泌、近分泌和自分泌因子在时空上协调子宫功能。但是,如果发生激素紊乱,P水平过早升高,子宫内膜组织中各类型细胞的发育不同步,也会影响胚胎的种植。据文献报道,卵巢刺激后子宫内膜转录组异常,在P水平过早升高的周期中,有45%以上的周期会发生子宫内膜组织学进展提前2 d,这可能是胚胎种植失败的潜在机制[17]。这一现象在另一项冻融胚胎移植周期研究中被验证,当在P水平过早升高的周期中产生的胚胎被玻璃化冷冻后,在随后的复苏移植周期中,正常妊娠率得以恢复[18]。另一项研究也表明,有四分之一的RIF患者表现为种植窗移位,对种植窗移位的RIF患者,使用子宫内膜容受性芯片检测,采用个体化移植,可获得正常的妊娠率和种植率[19]。

子宫内膜厚度是子宫内膜容受性的最直观的指标,内膜厚度达9～14 mm时,有利于胚胎植入[20]。Peel等[21]研究结果显示,与未妊娠组相比,妊娠组HCG日子宫内膜厚度明显较高,不同子宫内膜厚度组妊娠率比较也显示在一定范围内妊娠率与子宫内膜厚度呈正相关。另一项研究显示,随着子宫内膜厚度从9 mm增长到16 mm,妊娠率则从53%增加到77%,这表明不同内膜厚度者的胚胎植入率确实存在显著差异[22]。我们的研究结果也表明子宫内膜厚度是RIF的独立影响因素,为上述研究发现提供了新的佐证。子宫内膜厚度对胚胎种植的影响可能和雌激素受体(ER)有关,ER通常处于较低水平,ER-ɑ是雌激素作用的主要受体。有研究证明,ER-ɑ缺失的小鼠子宫发育不良且不孕[23]。另一项前瞻性研究发现,子宫内膜厚度欠佳的女性表现出异常的ER-ɑ表达模式,与ER-ɑ相关连的基因也存在差异表达,这些基因可能通过影响增殖和血管生成从而在种植过程中发挥作用,可能是子宫内膜厚度影响胚胎种植的潜在机制[24]。

Gn使用天数对RIF的影响研究较少。我们的回归分析显示Gn使用天数是RIF的独立影响因素,Gn使用时间越短,发生RIF的风险越高。刘闯等[25]的研究显示,在冻融胚胎移植周期,Gn促排卵时间与胚胎植入率和临床妊娠率无显著相关性,进一步分析各组Gn用量和促排卵时间对结局交互作用影响,结果显示Gn促排时间≥15 d,且Gn累积用量≥40支时,冻融胚胎移植周期的胚胎植入率和临床妊娠率显著下降。关于Gn使用时间对RIF的影响还需要更深入的研究来评价。

RIF的另一个影响因素则是胚胎自身因素。许多研究发现胚胎遗传物质异常主要体现在染色体数目异常及结构异常。已证实不同年龄患者形态学正常的优质胚胎其染色体非整倍体的发生率存在显著差异,随着患者年龄的增长,胚胎染色体非整倍体的发生率也随之增高,RIF患者胚胎染色体非整倍体的发生率显著高于非RIF的对照组[26]。另外,染色体结构异常如易位、倒位、缺失及嵌合体也会影响胚胎的种植和发育[27]。

综上所述,本研究提示女方年龄、不孕年限、HCG日内膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天数为RIF的独立危险因素,在临床诊疗过程中要特别注意上述因素的变化,及时进行治疗和干预。但由于本研究属于回顾性研究,且影响RIF的混杂因素较多,还需在今后的工作中进行多中心的前瞻性研究以进一步验证。