MTHFR基因多态性与贵阳地区原发性不育症的关系研究

汤贤英，杨杰，刘美，金平，李玉权

(贵阳市妇幼保健院优生遗传科,贵阳 550003)

生殖健康一直是全球关注的热点。在不孕不育夫妇中,约50%为男性不育[1]。男性不育与损害精子发生的先天性、后天性或特发性因素有关,而大多数的男性不育原因不明,为特发性男性不育,表现为无精子症或少精子症。在人类精子形成过程中,精子头部染色质的适当浓缩可促使精子成熟并具有受精能力以及胚胎的发育,这一过程有赖于DNA的正确甲基化,而异常的DNA甲基化导致精子变异引发不育[2]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydofolate reductase,MTHFR)通过促进5-甲基四氢叶酸酸的合成,为甲硫氨酸和同型半胱氨酸(Hcy)的合成与代谢提供原料,在DNA合成与甲基化中发挥着重要作用[3]。MTHFR基因的多态性,尤其是C677T与多种疾病有关,如心血管疾病、癌症、血管疾病、先天性唇腭裂、流产等,其原因可能与该多态性导致的高水平Hcy相关[3-4]。现有的研究显示,MTHFR基因的多态性可能是男性不育的遗传性危险因素之一[5-6],但有文献报道二者之间并无相关性[7],究其原因,可能与地区、种族差异等有关。本研究通过检测贵阳地区男性不育症患者的MTHFR基因多态性,探讨MTHFR基因多态性是否是贵阳地区原发性男性不育症的遗传危险因素。

一、资料与方法

1.研究对象:参照2012年欧洲泌尿外科学会男性不育症诊疗指南[8]选取2018年1月至2021年12月期间就诊于贵阳市妇幼保健院生殖中心的254例原发性男性不育患者为病例组,年龄19～50岁。纳入标准:(1)婚后1年或1年以上、有正常性生活、未采取避孕措施未能使配偶怀孕;(2)两次精液常规检测确诊为少弱精子症。排除标准:(1)女方不孕因素;(2)隐睾及睾丸发育不良等生殖器发育异常者;(3)严重精索静脉曲张、附睾损伤、生殖系统感染、染色体异常等因素所致不育者。同时,选取配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例为对照组,均为同期就诊于贵阳市妇幼保健院的体检人员,年龄20～47岁。所有入组人员均签署知情同意书。

2.MTHFR基因677、1298位点多态性检测:EDTA抗凝管采集病例组和对照组外周血2～3 ml。严格按血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技)说明提取DNA,按照叶酸代谢能力(MTHFR)基因检测试剂盒(江西诺德)操作程序检测MTHFR基因677和1298位点的基因型。PCR扩增程序:95℃变性10 min,95℃变性15 s、60℃退火45 s,40个循环。

3.统计学分析:采用SPSS17.0软件进行数据分析。以百分数(%)表示基因型、等位基因频率,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.患者的一般资料:本研究纳入254例患者均为贵阳地区常住居民,年龄19～50岁,平均年龄(32.98±7.18)岁;对照组为配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例,年龄20～47岁,平均年龄(32.61±6.08)岁。两组研究对象根据MTHFR基因检测结果将677位点分为CC型、CT型、TT型3个亚组;1298位点分为AA型、AC型、CC型3个亚组。

2.MTHFR基因677位点基因型及等位基因频率分布情况:病例组和对照组的MTHFR基因677位点TT型基因频率分别为14.17%、14.71%,两组相比无统计学差异(P>0.05);两组间T等位基因频率相似,分别为37.60%和36.13%,亦无统计学差异(P>0.05)(表1)。病例组及对照组中均未发现同一个体发生两个位点纯合突变的情况,即无MTHFR677TT基因型复合1298CC基因型的情况。

表1 两组间MTHFR基因677位点基因型频率及等位基因频率比较[n(%)］

3.MTHFR基因1298位点基因型及等位基因频率分布情况:病例组MTHFR基因1298位点CC基因型频率5.51%,高于对照组(3.78%),但差异无统计学意义(P>0.05);两组间C等位基因频率亦无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组间MTHFR基因1298位点基因型频率及等位基因频率比较[n(%)］

三、讨论

现有研究发现,MTHFR基因多个位点易发生单核苷酸变异,呈现多态性。其中,677和1298位点为目前研究较多且变异频率较高的位点,并显示与多种疾病的易感性相关[3-5,9-10]。MTHFR677位点胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C),使该位点呈现出CC(野生型)、CT(杂合突变型)以及TT(纯合突变型)三种基因型;1298位点胞嘧啶(C)取代腺嘌呤(A),呈现AA、AC、CC三种基因型。这两个位点的基因突变均可降低MTHFR酶活性,尤以677TT基因型酶活性降低最为显著,约降低了50%～60%,阻碍了叶酸的正常代谢[3,9],进而破坏了甲硫氨酸和Hcy的合成与代谢平衡,导致异常的DNA合成与甲基化、DNA修复等,影响精子的成熟与受精能力,这可能是MTHFR基因多态性导致原发性男性不育的原因之一[2-4],亦是MTHFR基因多态性与原发性男性不育症相关性研究的热点之一。

近年来,不断有相关的研究或荟萃分析报道MTHFR基因多态性与原发性男性不育的可能关系[5-6,9-13],MTHFRC677T与无精子症和少精子症的关系存在着种族和地域的差异:如在亚洲、印第安及土耳其人群中,MTHFRC677T是无精子症和少精子症的遗传危险因子[6,11-12];而在波兰及巴基斯坦人中,MTHFRC677T并不是非梗阻性男性不育症的主要遗传危险因子[9,13];一项C677T多态性与男性不育症的关联分析[7]发现,在东亚人和西亚人种族中MTHFRC677T与男性不育风险增加有关,而在其他种族(如高加索人和非洲人)不存在这种相关性。

Yang等[14]的研究报告指出,我国汉族人群中MTHFR677 T等位基因频率显示自北向南逐渐降低的趋势,山东最高为63.1%、海南最低为24%,TT基因型分别为40.8%、6.4%,这为解释国内各地677TT基因型与原发性男性不育症相关性存在地区差异提供了一种可能。但也有研究显示,各地区原发性男性不育症与MTHFR基因多态性的关系并未遵循这一趋势,如四川、湖北、徐州、宁夏(汉族)等地区的研究显示MTHFRC677T与无精子症和少精子症有相关性[15-20],而在中国中部和东部省份MTHFRC677T与汉族特发性男性不育症无关联[21-23]。本研究结果显示,MTHFRC677T、A1298C基因多态性在贵阳地区贵州籍原发性男性不育症(无精子症和少子精症)患者与那些有证实生育力的对照男性之间并无显著性差异,说明MTHFR基因多态性与原发性男性不育症的相关性存在不一致性,并不能单纯地用地域差异来解释,而是提示可能存在多种遗传因素或环境因素影响疾病的遗传风险。导致这种差异的可能相关因素如下:(1)其他与男性不育有关的尚未确定的致病基因的存在掩盖了MTHFR基因多态性的影响;(2)基因与基因间的相互作用,如与其他Hcy代谢相关的基因多态性因素互相叠加或干扰有关;(3)种族、民族因素:现有研究显示在欧洲人、北美人和中国人,以及国内多个民族中均观察到MTHFR677T等位基因频率差异[24-25],这种差异可能对疾病遗传危险因素的判定产生影响;(4)饮食因素:有研究提示饮食也是一种与男性不育及其他疾病相关的环境因素[7]。在具有MTHFRC677T多态性T等位基因的男性中,足量的维生素B9(叶酸)和B12(钴胺素)摄入在降低同型半胱氨酸水平、改善精子浓度和活力方面发挥关键作用[26],提示MTHFR基因多态性与微量营养素之间的相互作用,可影响同型半胱氨酸代谢途径的效率,进而影响MTHFR基因多态性与相关疾病遗传风险的评估;(5)其他环境因素。

本研究的研究对象均来自于贵阳地区常住人口,由于样本量小,不排除结论存在偏倚性;其次,贵州地处西南,饮食结构多样化,富含叶酸食物种类繁多,可能降低了MTHFR基因C677T多态性对男性不育的影响。随着经济的发展、生活水平日益改善,人们对生殖健康的关注或重视日益提高,对微量元素的足量摄入亦逐渐重视,本研究不排除对照组人员摄入足量微量元素可能影响了MTHFR基因C677T多态性与男性不育相关性的判断。此外,贵州是多民族聚居地区,不同民族间可能存在基因多态性的差异、人口迁移等因素。本研究中亦有少数民族样本存在,但因样本量小不足以探讨MTHFR基因多态性在不同民族男性不育症间的差异。因此,后续研究有必要进一步加大样本量,并增加民族、饮食结构以及影响DNA甲基化的其他基因的调查,进而深入探讨MTHFR基因多态性与贵州地区原发性男性不育的关系以及相互作用的机制,指导男性不育症的预防和治疗。