FⅧ抑制物与狼疮抗凝物对凝血因子检测结果的影响

颜楠,刁艳君,韩峰,刘家云(空军军医大学附属西京医院检验科,西安 710032)

关于获得性凝血因子Ⅷ(FⅧ)抑制物的来源,一种是非血友病患者产生的抗FⅧ自身抗体,另一种是血友病患者接受外源性凝血因子产品输注后产生的抗FⅧ同种抗体[1]。抑制物形成受多种因素影响,遗传和治疗因素协同作用促成抑制物产生,表现为出血不止或出血难止,出血的严重程度主要取决于凝血因子水平[2]。狼疮抗凝物(Lupus anticoagulants,LAC)是一种抗磷脂抗体,在体外试验中,LAC可通过拮抗带负电荷的磷脂或磷脂-蛋白质复合物,干扰凝血试剂使凝血时间假性延长,在体内LAC则是强烈的促凝物质,诱导组织因子表达、干扰纤溶酶原激活物释放、激活血小板、影响补体活化、抑制蛋白C,使人体呈现病理性高凝状态,是引发静、动脉血栓形成的重要风险因素[3-4]。FⅧ抑制物与LAC都会引起活化部分凝血活酶时间(APTT)延长,甚至干扰依赖APTT试剂检测的内源性凝血因子的定量检测,因此在凝血因子定量检测时含量均同时减低的患者,需要排除是否存在病理性抑制物的干扰引起的假性减低[5]。通过对内源性凝血因子的多梯度稀释检测可以辨别FⅧ抑制物与LAC。

1 材料和方法

1.1研究对象 回顾性分析我院2022年2月至2023年2月门诊与住院病例。收集FⅧ抑制物阳性致内源性凝血因子活性假性减低组6例,均为男性,年龄9～64(40.0±22.6)岁;LAC阳性致内源性凝血因子活性假性减低组15例,男1例,女14例,年龄11～60(34.5±15.5)岁。

1.2仪器与试剂 CS5100全自动凝血分析仪(日本Sysmex公司)。APTT、凝血酶原时间(PT)、LAC试剂以及FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性试剂购自德国SIEMENS公司。

1.3方法 清晨空腹抽取静脉血2.7 mL,枸橼酸钠抗凝,1 500×g离心10 min后分离血浆。

FⅧ抑制物组:检测PT、APTT以及内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性及其稀释3个梯度后的活性,进行APTT纠正试验,检测FⅧ抑制物、LAC(LA1/LA2)。

LAC组:分别检测LAC(LA1/LA2),检测内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性及其稀释3个梯度后的活性。

2 结果

FⅧ抑制物组6例患者APTT延长显著(见表1)且APTT纠正试验均不纠正(见表2);内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性均减低,其中FⅧ活性减低最显著(见表1);经3个梯度(1∶2、1∶4、1∶8)稀释,FⅧ活性稀释后变化均较小,FⅨ、FⅪ、FⅫ活性稀释后均恢复为接近正常水平(见图1)。FⅧ抑制物结果均为阳性,LAC(LA1/LA2)检测结果均为阴性(见表2)。

表1 FⅧ抑制物组6例患者PT、APTT与内源性凝血因子结果

注:A～F分别为患者1～6。图1 FⅧ抑制物组6例患者内源性凝血因子活性在不同稀释度下的变化曲线

表2 FⅧ抑制物组6例患者APTT纠正试验、FⅧ抑制物与LAC结果

将LAC组15例LAC阳性患者内源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性稀释前后检测结果进行对比分析,差异均有统计学意义(P<0.05),且均能恢复至接近正常水平(见表3)。通过对比FⅧ抑制物组和LAC组稀释后的FⅧ活性(见图2),可有效鉴别FⅧ抑制物与LAC。

表3 LAC组患者各内源性凝血因子稀释前后结果比较

图2 LAC组与FⅧ抑制物组FⅧ活性不同梯度稀释检测对比

3 讨论

抑制物的产生可分为遗传因素和非遗传因素,遗传因素是主要因素,后者为次要因素[6]。FⅧ抑制物筛选采用APTT纠正试验,由于FⅧ抑制物有时间温度依赖性,因此若APTT即刻被纠正,则需要进一步进行37 ℃温育2 h后的纠正试验[7]。FⅧ抑制物滴度检测采用改良的Bestheda法[8]。用不同稀释度的患者血浆与正常血浆等量混合温育2 h,测定残余FⅧ活性。能使正常血浆FⅧ活性减少50%时,FⅧ抑制物的含量为1个Bethesda单位,以BU/μL表示[9]。LAC是一种能与带负电荷的磷脂或磷脂蛋白复合物结合的免疫球蛋白,属于抗磷脂抗体可干扰依赖磷脂的体外凝血反应[10],其机制为血浆中的LAC能中和APTT试剂中的磷脂,导致凝血时间延长[11]。APTT检测参与的凝血因子主要有FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ,当其时间延长时提示内源性凝血功能障碍[12]。行标中对标本的稀释要求规定,因子Ⅷ和Ⅸ活性检测至少应进行2个稀释度的检测[13]。

本研究FⅧ抑制物组中6例患者APTT延长显著且APTT纠正试验均不纠正,提示可能有病理抑制物存在。本研究中,内源性凝血因子活性均减低,其中FⅧ活性减低最显著,稀释不同梯度后检测,除FⅧ外其他因子均恢复至接近正常水平;提示可能存在FⅧ抑制物。LAC组中对15例患者的内源性凝血因子活性进行不同梯度稀释检测,差异均有统计学意义(P<0.05),且均能恢复至接近正常水平。

FⅧ抑制物与LAC均为病理性抗凝物质,实验室诊断病理性抗凝物质的确证试验较为复杂或尚无参考物质和参考方法,分析前、分析中诸多因素均可影响检测结果的准确性和重复性,其临床应用效果不是非常理想[14]。通过对凝血因子多梯度稀释的方法不仅可以排除病理性抗凝物质的干扰,甚至可辨别抑制物与LAC。为临床早期诊断和治疗提供依据,同时也是对不能开展FⅧ抑制物与LAC检测的实验室的有效补充。