2种品牌粪便血红蛋白和转铁蛋白胶体金免疫层析试纸检测限和检出率比较*

王娟,孙婷婷,武爱文,冷家骅,刘汝锋,王悦,徐国宾(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,.检验科,.胃肠肿瘤中心,北京 100142)

粪便血红蛋白(hemoglobin,Hb)是辅助消化道出血诊断的标志物,多采用胶体金免疫层析法进行定性检测。具有更高检测灵敏度的粪便血红蛋白免疫学定量检测(fecal immunological test,FIT)被各国指南推荐用于结直肠癌筛查[1]。Hb可经胃黏膜分泌的消化酶和肠道细菌的分解被降解,免疫反应性减弱甚至导致检测结果呈假阴性[2]。转铁蛋白(transferrin,Trf)不易被胃酸和肠道细菌降解,在粪便中的稳定性高于Hb。文献报道粪便Hb与Trf联合定性检测的阳性率显著高于Hb单检[3]。粪便Hb和Trf联检对于消化道出血的筛检率高,受到推荐。粪便Hb和Trf定性与定量检测试剂品牌多,其检测灵敏度影响粪便检出的阳性率。本研究旨在了解几种胶体金定性试纸检测下限是否与说明书标示值相符,观察不同品牌试纸检测粪便样本Hb和Trf的阳性率,比较不同品牌试纸单检和联检的阳性率与检测一致性。

1 材料与方法

1.1粪便样本收集 连续收集2022年7月至9月北京大学肿瘤医院住院患者送检的粪便样本268例,男144例,女124例,年龄20～81岁,平均年龄56.7岁。本研究获得北京大学肿瘤医院伦理委员会批准(批件号:2022YJZ57)。入选患者于入院前均签署样本可用于临床研究的同意书。粪便样本留取后2 h内完成检测。

1.2Hb和Trf标准液配制

1.2.1Hb、Trf储存液配制 取比色法测定Hb浓度为100 g/L的人全血样本1 mL,加入蒸馏水破坏红细胞并定容至100 mL,配制得1 g/L Hb储存液[4]。取免疫比浊法测定Trf浓度为2 g/L的血清样本2 mL,加入生理盐水定容至100 mL,配制得40 mg/L Trf储存液。

1.2.2胶体金试纸检测限确定 用各厂家试剂盒配套的样本稀释液倍比稀释储存液配制Hb、Trf应用液。稀释后的Hb、Trf应用液浓度分别为1 μg/mL、0.8 μg/mL、0.6 μg/mL、0.4 μg/mL、0.2 μg/mL、0.15 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.01 μg/mL以及400 ng/mL、300 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、8 ng/mL。使用不同品牌的Hb和Trf试纸平行检测不同浓度应用液10次,检测结果均为阳性的Hb或Trf最低应用液浓度定义为该试纸的检测下限。

1.3统计学分析 用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分比表示,组间率的比较采用配对卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1检测限 Hb浓度≥150 ng/mL,Trf浓度≥40 ng/mL时,A、B 2种品牌试纸10次检测结果均为阳性。Hb浓度<50 ng/mL,Trf浓度<10 ng/mL时,A、B 2种品牌试纸10次检测结果均为阴性。A、B 2种品牌试纸的Hb检测限为150 ng/mL,Trf为40 ng/mL。检测结果见表1。

表1 2种品牌胶体金试纸检测不同浓度Hb、Trf溶液结果(n=10)

2.2粪便样本Hb和Trf检出率 用A、B 2种品牌试纸同时检测268例粪便样本Hb和Trf,结果见表2。A品牌试纸Hb单检阳性率(42.5%)和联合Trf检测阳性率(60.1%)均高于B品牌(28.4%、55.2%)(P<0.05);2种品牌试纸Hb、Trf联合检测阳性率均高于单检,差异有统计学意义。虽然A、B 2种品牌试纸Hb、Trf检测下限相同,但患者粪便样本检测阳性率有差异。2种品牌试纸Hb和Trf检测结果均为+/+、+/-、-/+和-/-的总一致性为80.2%(215/268)。结果表明2种品牌Hb和Trf完全一致率未达到预期值(如90%以上)。进一步观察发现,2种品牌试纸Hb、Trf阳性一致率分别为65.2%(75/115)和88.3%(121/137)。B品牌Hb检出率低是2种品牌检测总一致性低的原因。

表2 2种品牌胶体金试纸检测粪便样本Hb和Trf的一致性(n=268)

A品牌试纸Hb/Trf +/+、+/-、-/+占总样本量(268例)的比例分别为29.9%、12.7%和17.5%,总阳性率为60.1%;B品牌试纸Hb/Trf +/+、+/-、-/+占比分别为22.0%、6.3%和26.9%,总阳性率为55.2%。2种品牌Hb、Trf联检阳性率差值为4.9%(60.1% vs 55.2%),低于2种品牌Hb检测阳性率的差值14%(42.5% vs 28.4%),说明联合粪便Trf检测可提高检出的总阳性率并减少消化道出血的漏检率。

A品牌Hb/Trf -/-的107例粪便样本中,B品牌Hb/Trf +/-、-/+分别有1例和7例,仅占7.5%(8/107)。B品牌Hb/Trf -/-的120例粪便样本中,A品牌Hb/Trf +/+、+/-、-/+分别有2例、16例和3例,占17.5%(21/120)。说明检出阳性率有差异的2种品牌均存在漏检情况,漏检样本可能多为Hb、Trf含量较低的样本。

3 讨论

消化道出血原因多。恶性肿瘤相关的消化道出血原因包括肿瘤浸润出血(23.8%)、消化道静脉曲张(19.7%)、消化道溃疡(16.3%)和消化道糜烂(10.9%)等[5-6]。抗肿瘤治疗(包括手术、放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗等)均有可能导致肿瘤坏死破溃、溃疡、感染或发生炎性肠病、门静脉高压,从而导致消化道出血[6-7]。对于怀疑有急性消化道出血的患者,应进行多学科会诊(MDT)评估,并进行紧急处理,对于慢性消化道出血者也应明确病因。消化道出血的临床表现因出血部位及出血速率而不同,轻者可无症状或伴有贫血及血容量减少,严重者可出现休克甚至危及生命,及时发现早期出血尤为重要。粪便Hb检测是广泛应用的快速筛查消化道出血的方法。Hb在胃肠道中的稳定性低于Trf,西京医院郝晓柯团队定性检测了363例肿瘤患者粪便样本Hb和Trf,单检和联检的阳性率分别为36.1%、46.0%和55.1%[8],联检较Hb单检阳性率高19.0%。本实验也观察到类似的结果。多项试验结果表明Hb和Trf联检的确可提高消化道出血的阳性检出率并减少部分出血的漏检,但粪便Hb与Trf单检和联检对上下消化道出血的筛检效能仍不明确,这可能是我国部分地区粪便Trf尚未列入医疗服务项目的原因。

本研究发现实际测量的A、B 2种品牌胶体金试纸Hb、Trf检测下限相同,均与试剂盒说明书标示灵敏度吻合,但2种品牌试纸检测粪便样本的阳性率有差异。我们认为这种阳性率的差异可能与膜试纸的结构和含水量影响胶体金标记抗体与检测靶抗原复合物的迁移速度有关,也可能与不同品牌试纸胶体金标记抗体检测抗原复合物稳定性受粪便基质影响程度不同有关。因此实现不同医院间粪便Hb、Trf定性检测结果的互通之路面临很多难题。我们在选择粪便Hb、Trf检测试剂时,除比较说明书宣称的检测灵敏度外,还应用倍比稀释的标准液验证标示的检测限,并比较临床送检粪便样本的阳性检出率。

目前已有免疫比浊、免疫荧光法定量检测粪便Hb、Trf的试剂盒问世,定量法较胶体金检测更敏感。观察粪便Hb、Trf、钙卫蛋白、乳铁蛋白等特种蛋白质定性与定量检测对于各种消化道肿瘤和消化道出血的筛查效能,明确粪便特种蛋白定量检测是否有助于急慢性消化道出血量的判断及其对消化道出血干预的影响是有意义的,需要进一步的研究。