凝血酶调节蛋白联合中性粒细胞肽酰基精氨酸脱亚氨酶4预警非瓣膜性房颤合并急性缺血性脑卒中患者缺血事件复发*

任杰,王竞,门剑龙,张鹏(.天津市西青医院检验科,天津 300380;.天津医科大学总医院精准医学中心,天津 30035)

非瓣膜性心房颤动(nonvalvular atrial Fibrillation,NVAF)是引发急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)的重要风险诱因[1],不但可造成血管栓塞,而且在短时间内易再次形成血栓,从而导致残疾或死亡的临床后果。目前,临床上对AIS患者血栓复发的早期识别能力仍存在明显不足,尤其缺乏利用生物标志物对脑血管缺血事件的预警研究。在前期研究中,我们通过血管损伤标志物对NVAF患者的缺血事件风险进行了早期预警的研究发现,血管损伤与患者的临床转归密切相关[2-3]。存在的问题是,现阶段可用于临床的实验室指标较少,尚不能满足临床对于NVAF相关缺血事件风险预警的需求。基于此,本研究对164例NVAF合并AIS患者的血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)和中性粒细胞肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(neutrophil peptidylarginine deiminase 4,PAD4)水平进行观察,分析水平变化特征和趋势,探索两项指标对于NVAF合并AIS患者缺血性事件复发的预警性能和临床价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 纳入2020年8月至2023年2月期间于天津市西青医院就诊的NVAF合并AIS患者164例为患者组,男71例,女93例,年龄51～83岁,中位年龄67.9岁;入组患者诊断标准参照《中国急性缺血性卒中诊疗指南2018》[4];入组患者排除重症感染、恶性肿瘤、心脏手术史、血液系统疾病、严重肝肾疾病和长期服用激素类等药物,发病前1个月均未接受抗凝及抗生素治疗。入组患者均在发病4.5 h内接受静脉溶栓。收集入组患者在治疗前和接受治疗7 d时的外周静脉血,第2次采集血液样本后,对入组患者进行为期90 d的随访,起止时间为2020年8月1日至2023年5月31日,以患者再次发生AIS及相关死亡为终点事件(缺血事件复发),患者组在随访期内有25例患者再次发生AIS,其中6例患者死亡。根据终点事件,将患者组进一步分为缺血事件复发组25例,未复发组139例。本研究通过天津市西青医院伦理委员会审批(批准文号:XQYYLL-2020-11)。

1.2标本采集、处理与检测 收集入组患者在治疗前和接受治疗7 d时的外周静脉血,以2 664×g离心15 min,枸橼酸钠抗凝管中的乏血小板血浆样本用于TM检测,分离胶促凝管中的血清样本用于PAD4检测。采用Shine i2900型全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂盒(化学发光免疫分析法,广州万孚生物公司)测定血浆凝血酶调节蛋白(thrombomodulin,TM)水平;采用Freedom EVO Clinical免疫分析加样仪和Sunrise酶标仪(瑞士TECAN公司)及PAD4测定试剂盒(武汉酶免科技生物有限公司)检测血清PAD4水平。上述两项实验均严格按照操作说明书进行。

1.3统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,以M(P25,P75)表示偏态分布的数据;以Kruskal-WallisH检验进行多组间比对,以Mann-WhitneyU检验进行两组间数据比对;用Friedman秩和检验进行同组内各时间节点数据比较;用ROC曲线分析诊断性能;用Logistic回归进行关联性分析;用Kaplan-Meier曲线进行生存分析,Cox比例风险回归模型评价TM和PAD4预测患者90 d内复发风险的性能;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1AIS患者TM和PAD4测定结果

2.1.1血浆TM测定结果 见表1。AIS患者组在治疗前、后的血浆TM水平均高于健康对照组,差异有统计学意义(U值分别为682.5和2 079.5,P值均<0.001)。

表1 AIS患者血浆TM测定结果

在治疗前和治疗后,复发组血浆TM水平均高于未复发组,差异有统计学意义(U值分别为399.0和200.5,P值均<0.001)。

AIS患者治疗后血浆TM水平低于治疗前(Z=-5.546,P<0.001),未复发组治疗后血浆TM水平低于治疗前(Z=-6.748,P<0.001),复发组治疗后TM水平与治疗前间差异无统计学意义(Z=-1.386,P=0.166)。

2.1.2血清PAD4测定结果 见表2。AIS患者组在治疗前、后血清PAD4水平均高于健康对照组,差异有统计学意义(U值分别为27.5和314.5,P值均<0.001)。

表2 AIS患者血清PAD4测定结果

治疗前,未复发组血清PAD4水平与复发组间的差异无统计学意义(U=1 370.0,P=0.093)。治疗后,复发组高于未复发组,差异有统计学意义(U=213.0,P<0.001)

AIS患者治疗后血清PAD4水平低于治疗前(Z=-7.888,P<0.001),未复发组治疗后血浆PAD4水平低于治疗前(Z=-10.229,P<0.001),复发组治疗后PAD4水平高于治疗前(Z=-3.996,P<0.001)。

2.2TM和PAD4预测AIS患者90 d随访期内缺血事件复发的ROC 见图1。治疗前,ROC曲线下面积(AUCROC)为0.885(95%CI:0.830～0.941),当血浆TM临界值为13.04 TU/mL时,诊断敏感性为84.0%,特异性为74.1%。治疗后,AUCROC为0.909(95%CI:0.860～0.957),当血浆TM临界值为10.52 TU/mL时,诊断敏感性为92.0%,特异性为74.8%。

治疗前,AUCROC为0.606(95%CI:0.500～0.711),当血清PAD4临界值为11.45 ng/mL时,诊断敏感性为84.0%,特异性为39.6%。治疗后,AUCROC为0.939(95%CI:0.899～0.979),当血浆PAD4临界值为10.00 ng/mL时,诊断敏感性为96.0%,特异性为62.6%。

采用TM联合PAD4进行评估,结果显示,治疗前的AUCROC为0.877(95%CI:0.814～0.939);治疗后的AUCROC为0.976(95%CI:0.955～0.997)。

2.3AIS患者治疗后TM和PAD4水平与临床病生理因素的多因素Logistic回归分析 表3显示,用Logistic回归进行多因素分析,AIS患者治疗后的TM、PAD4水平均与性别和血管疾病无显著相关性(P>0.05),与充血性心力衰竭和高血压有显著相关性(P<0.05)。

表3 TM和PAD4水平与临床病生理因素的Logistic多元分析

2.4生存分析 见图2。与低于临界值的AIS患者比较,治疗后血浆TM水平高于临界值(10.52 TU/mL)的患者与在90 d随访期内缺血事件复发的累积风险概率显著增高(Log-rankχ2=20.597,P<0.001),治疗后血清PAD4水平高于临界值(≥10.00 ng/mL)的患者在90 d随访期内缺血事件复发的累积风险概率显著增高(Log-rankχ2=5.836,P=0.016),TM联合PAD4在90 d随访期内缺血事件复发的累积风险概率显著增高(Log-rankχ2=27.786,P<0.001)。

注:绿色虚线为高于临界值,蓝色实线为低于临界值;A、B、C分别为TM、PAD4、TM联合PAD4。图2 AIS患者在治疗后90 d内缺血事件复发的累积风险概率

2.5Cox回归分析 见表4。对AIS患者进行治疗后90 d的随访,用Cox回归模型分析TM和PAD4预测患者缺血事件复发的HR值为1.335和1.162,提示单独使用TM或PAD4均不能独立预测随访期内的缺血事件复发风险。将TM与PAD4联合评估,HR值为1.397(P=0.036),表明两项指标联合分析可有效预测随访期内缺血事件复发风险。

表4 Cox回归分析TM和PAD4预测AIS患者治疗后90 d内缺血事件复发

3 讨论

TM是一种表达于血管内皮细胞表面的单链跨膜糖蛋白,有多个结构域,参与调控凝血、免疫等多种生物过程,对维持人体器官正常功能具有重要意义[5]。在生理状态下,TM通过与凝血酶形成复合物,激活蛋白C以灭活凝血因子Ⅴa和Ⅷa,下调凝血酶生成以实现抗凝效应。游离于血浆中的TM是一类结构不完整的可溶性TM片段,其血浆浓度显著增高多见于严重的血管损伤[6]。中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是一种由颗粒衍生蛋白修饰的DNA支架组成的胞外网状结构,具有促炎和抗炎双重作用,但NETs的过表达对机体的损害超过其保护作用。NETs的抗炎特性与血栓形成密切相关,有研究显示其过量生成在AIS的发病机制中起关键作用[7],几乎在所有类型的AIS患者的血栓栓子中均可发现NETs结构,在NVAF合并AIS的致病过程中也发挥重要作用,同时NETs生成或清除不力对脑卒中后的血管重建和血管修复产生负面影响[8]。PAD4是NETs形成的关键酶,在NETs表达过程中参与诱导组蛋白瓜氨酸化[9],因此血清中PAD4的含量可反映外周血中NETs的生成水平。

本研究显示,AIS患者发病的急性期,血浆TM水平显著增高,提示由于NVAF所致血流动力学异常引发较为严重的血管损伤,导致TM从血管内皮细胞膜表面大量脱落到血浆中。进一步的分析显示,在随访期内复发缺血事件的患者,其在治疗前阶段时血浆TM水平即显著高于未复发的患者;在治疗后,随访期内未复发缺血事件患者的血浆TM水平显著降低,而复发缺血事件的患者则与治疗前无显著差异,仍处于高水平。上述特征表明,由于持续的血管损伤是NVAF患者发生AIS的重要驱动因素和病理基础,而高水平的血浆TM则是血管内皮细胞受损的标志,因此如患者血浆TM持续处于高水平,提示血管损伤趋势并未得到缓解。

血清PAD4水平的显著增高与血管损伤后的NETs相关炎性过程密切相关。有研究表明,外周血中的NETs相关生物标志物水平在动脉血管病变时发生显著改变,并与病情严重程度、临床结局显著相关[10]。在研究中发现,血清PAD4水平在AIS发病的急性期(治疗前)显著增高,在治疗后阶段,随访期内未复发缺血事件的患者的PAD4水平出现显著降低,而随访期内复发缺血事件的患者则较治疗前水平更高,则进一步表明血管壁炎性损害持续存在,并参与构成了血栓前状态和缺血事件复发的病理基础。

ROC曲线分析显示,以治疗前的血浆TM水平对随访期内缺血事件的预警性能优于PAD4;在治疗后,TM和PAD4预测随访期内缺血事件均具有良好的诊断性能,其原因可能与TM和PAD4对于血管损伤的反应机制不同有关。在血栓形成的急性期,血管内皮的显著损伤既是血栓形成驱动因素,同时在血栓形成后仍可进一步加重,TM作为敏感反映血管内皮受损的标志物,其血浆水平变化伴随疾病发生发展的全过程;PAD4作为NETs的标志物,虽然在血管壁炎性病变过程中存在上调表达的趋势,但NVAF患者在AIS发生的急性期,其缺血事件主要为心源性栓子脱落所致,因此PAD4的表达水平与该阶段病理过程的关联性较弱,但在随访期内,PAD4基于其在血管重建过程中的角色,对于缺血事件复发的预警性能略优于TM。Logistic回归分析也显示,TM和PAD4与充血性心力衰竭和高血压等临床因素均有显著关联性,说明两项指标的变化趋势受到多种与血管损伤相关因素的影响和制约,本研究将TM和PAD4进行联合ROC曲线分析,进一步提高了在随访期内缺血事件的预警性能。

生存分析和Cox回归分析结果显示,与低于临界值的患者比较,治疗后TM水平或PAD4水平仍高于临界值的患者与在随访期内缺血事件复发的累积风险概率显著增高,但两项指标的单独评估时,其HR值为1.335和1.162(P值均>0.05),提示均不能具有独立预测缺血事件复发风险的能力。本文将TM与PAD4做联合评估,其HR值为1.397(P<0.05),表明两项指标联合分析可有效预测AIS患者的缺血事件复发风险。

综上所述,NVAF并发AIS患者由于存在严重的血管损伤,其TM和PAD4水平显著增高,并随病情发展而改变,通过对上述两项指标的动态监测和联合评估,可有效预警AIS患者缺血事件复发的风险,为临床早期识别和及时干预提供依据。