FLAG标签纳米抗体的筛选、表达及验证

王欣怡 王晓倩 王红军 晁跃辉

（1. 北京林业大学草业与草原学院，北京 100083；2. 北京泰德制药股份有限公司，北京 100176）

1993年，Hamers‑Casterman等［1］首次在骆驼血清中发现了一种新型抗体，被称为重链抗体（heavy chain antibodies, HCAbs）。这种抗体由CH2、CH3、铰链区和重链可变区（heavy chain variable domain,VHH）组成，天然缺失轻链和重链的CH1区（heavy chain constant region）。HCAbs的N端可变区，也称为单域抗体（single domain antibody, sdAb），具有直径约为2.5 nm和长度约为4 nm的尺寸，因其结构简单和尺寸小，也被称为纳米抗体（nanobody,Nb）［2］。科学家们在羊驼、单峰驼、美洲驼等驼科动物，以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中发现了类似结构的抗体［1,3］。

纳米抗体是目前已知的具有完整功能、稳定且能够结合抗原的最小单位［4］。相较于常规抗体，纳米抗体具有诸多优点，例如相对分子质量小、易于生产和改造、特异性和亲和力高、稳定性和可溶性高、组织渗透性强、易清除、易表达、免疫原性弱和能够识别缝隙表位等［2,5-6］。因此，在基础研究、分子成像、亲和纯化基质、诊断试剂、新药开发、疾病诊断和治疗等领域，纳米抗体具有广泛的应用。例如，纳米抗体可作为肿瘤成像［7］和分子成像［8］的小分子探针、蛋白质或大分子复合物的结晶伴侣［9］、理想的毒素中和剂［10］，以及用于癌症治疗的抗肿瘤药物［11］。曹飞婷等［12］利用噬菌体筛选技术，成功筛选出抗小鼠IgG的纳米抗体，并制备出特异性亲和小鼠IgG的亲和层析介质。Orlov等［13］分离出抑制葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus, GFLV）的纳米抗体Nb23，在烟草和葡萄砧木中稳定表达并观察到对GFLV的特异性抵抗力。Ahmadi等［14］总结了几种蝎子毒液治疗的抗毒剂，因具有较低的免疫原性和较高的体外稳定性，纳米抗体可以发展为下一代蝎子抗毒血清。Uchański等［15］通过将纳米抗体嫁接到选定的支架蛋白质上，以产生稳定且有效折叠的单体嵌合体并开发了巨型抗体。

FLAG融合标签是一个由8个氨基酸（Asp·Tyr·Lys·Asp·Asp·Asp·Asp·Lys）组成的亲水性短肽，专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化工作［16］。利用FLAG融合标签，可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统，简化蛋白质的纯化过程，控制蛋白质固定的空间取向，并方便检测和体内生物事件的可视化，提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等［17］。具有FLAG标签的融合蛋白具有以下优点：（1）序列短小，只需一条人工合成的寡核苷酸链即可编码该抗原肽；（2）含有一个肠激酶切割位点，肠激酶可以识别该短肽C端的5个氨基酸（Asp·Asp·Asp·Asp·Lys），通过肠激酶处理除去标签后可以获得天然的非融合蛋白质［16］；（3）融合在N端的FLAG序列很稳定，且不会被大肠杆菌蛋白酶除去；此外，目的蛋白N端融合FLAG标签后C末端还可以融合其他模块；（4）融合有FLAG标签的目的蛋白可直接通过FLAG进行亲和层析，可纯化有活性的融合蛋白且纯化效率高；（5）抗FLAG的抗体可有效识别FLAG标签，可以通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG标签的融合蛋白进行检测和鉴定［18］。然而，目前商品化的FLAG标签抗体均为传统类型的抗体，稳定性差、不易保存、制备成本较高。因此，将FLAG标签蛋白与纳米抗体库中的抗体进行相互作用筛选，可以快速、高通量地筛选出亲和力较高和特异性较强的抗体。这对于FLAG标签蛋白的检测、定位和纯化等方面具有十分重要的意义。

纳米抗体筛选主要通过噬菌体展示技术和酵母双杂交技术两种方法。噬菌体展示技术基于噬菌体的表面展示技术，通过将感兴趣的抗原蛋白与噬菌体表面的蛋白进行融合，并使用噬菌体库进行筛选，最终获得与目标抗原高度特异性结合的纳米抗体。该技术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，能够应用于筛选各种抗原结合的纳米抗体［19］。但噬菌体文库的库容非常大，其随机多样性可达107-109，筛选抗体需要特异、高效的筛选方法［20］。酵母双杂交技术是利用酵母双杂交系统进行筛选，该技术基于酵母细胞中的转录因子分为两个部分：DNA结合域（DNA‑binding domain, BD）和激活域（activation domain, AD），分别发挥结合DNA和激活转录的作用。将待筛选的纳米抗体与AD域融合，而作为抗原的蛋白质与BD域融合，分别连接到两个不同的载体上，然后将这两个载体一起转染到酵母细胞中。若这两个蛋白相互作用，则BD和AD结合形成一个功能完整的转录因子，激活其下游靶基因的表达，通过筛选生长特征正常的菌落，可以鉴定出这两个蛋白质之间的相互作用。该技术具有灵敏度高、选择性强、操作简单等优点，能够筛选出高亲和力的纳米抗体［21］。噬菌体展示技术和酵母双杂交技术在纳米抗体筛选方面各有优劣。噬菌体展示技术可以直接筛选出抗原结合的纳米抗体，具有高效性和高特异性，但是需要构建大规模的噬菌体库，且需要进行后续的体外生物学实验。使用酵母双杂交技术进行筛选，不需要构建大规模的噬菌体库，且可以在体内进行筛选和验证。由于酵母菌属于真核细胞生物，所以与噬菌体表面展示技术相比，能够更好地维持抗原抗体的生物活性。

在本研究中，通过酵母双杂交技术筛选、表达和验证，成功获得了两株具有特异性识别FLAG标签蛋白能力的纳米抗体。这种简便易行的FLAG标签技术具有很好的应用潜力，而纳米抗体的制备和验证为FLAG标签技术的更广泛应用提供了理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的驼源纳米抗体文库为北京林业大学草业与草原学院构建并保存。限制性内切酶Sma I、Xba I和Bgl II，酵母转化试剂盒等购买于TaKaRa公司。细胞质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等购买于OMEGA公司。彩色预染蛋白Marker（10-170 kD）、原核表达菌株BL21购买于上海碧云天生物技术公司。鼠源Anti‑Strep Tag II、HRP‑conjugated Goat Anti‑Mouse lgG、兔源HRP‑conjugated Anti‑Camelid VHH抗体购买于生工生物工程公司。大肠杆菌DH5α感受态、酵母菌Y2H Gold及Y187菌株等均为北京林业大学草业与草原学院实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 应用软件Primer Premier 5进行引物设计，其中pGBKT7‑FLAG‑F和pGBKT7‑FLAG‑R用于FLAG标签酵母双杂交筛库载体的构建；pCold‑VHH‑F和pCold‑VHH‑R用于原核表达载体的构建（表1）。

表1 本试验所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.2 pGBKT7‑FLAG载体的构建 使用pGBKT7‑FLAG‑F和pGBKT7‑FLAG‑R引物，通过链间退火的方法使两条反向互补引物，形成双链结构，具体操作为：95℃ 5 min；‑0.2℃/s，25℃ 5 min。提取pGBKT7质粒在30℃条件下使用Sma I酶切15 min；使用DNA纯化试剂盒，纯化并回收酶切产物，使用无缝连接酶在50℃条件下，将酶切及复性产物连接15 min，连接产物转化大肠杆菌DH5α中并涂布在含卡纳霉素的LB固体培养基上。使用通用引物T7 promoter和3′BD对单菌落进行PCR鉴定，并将阳性单克隆菌落送至生物技术公司测序，将测序正确的载体命名为pGBKT7‑FLAG。

1.2.3 酵母转化 使用质粒提取试剂盒从测序正确的大肠杆菌中提取pGBKT7‑FLAG质粒，并使用酵母转化试剂盒将pGBKT7‑FLAG转入到Y2H Gold酵母菌株中，涂布在SD/‑Trp固体培养基上，放置于30℃恒温培养箱直至出现单菌落，挑取单克隆酵母菌落，经PCR检测后保存测序正确的pGBKT7‑FLAG酵母菌液。

1.2.4 酵母双杂筛选 将含有pGBKT7‑FLAG的Y2H Gold酵母菌摇菌，离心弃上清后用SD/‑Trp液体培养基重悬浮，加入纳米抗体文库菌液（酵母菌Y187）和2×YPDA液体培养基，放置于恒温振荡培养箱，温度设置为29.5℃，时间为20 h，培养结束离心弃上清，并使用0.5×YPDA液体培养基重悬浮后，涂布于四缺培养基SD/‑Trp/‑Leu/‑His/‑Ade/X‑α-Gal/AbA，放置于30℃恒温培养箱培养3-4 d后，挑取生长状态良好且呈现蓝色的单菌落进行扩大培养，并提取酵母质粒。使用引物T7 promoter与3′AD进行PCR检测，将含有阳性条带的质粒送至北京睿博兴科生物公司测序，并保存测序结果。

1.2.5 “点对点”验证 将能够在四缺培养基上正常生长，并且呈现蓝色的单菌落，提取酵母质粒，使用酵母转化试剂盒将提取的质粒重新转入到Y187酵母菌株中，涂布在SD/‑Leu培养基进行筛选，单克隆菌落经PCR检测和测序后，进行保存，以备后续使用。将重新转化的Y187酵母菌分别与含有诱饵载体pGBKT7‑FLAG、pGBKT7空载Y2H Gold酵母菌分别组合进行酵母有性杂交，然后将每个组合分别稀释10倍、100倍、1 000倍，将稀释后的菌液吸取10 μL分浓度梯度涂于四缺培养基SD/‑Trp/‑Leu/‑His/‑Ade/X-α-Gal/AbA上，放置于恒温培养箱中倒置培养3-4 d后，观察并记录分析菌落生长状态及颜色变化。

1.2.6 原核表达载体构建 由于pGADT7 AD与pCold‑SUMO载体，均含有氨苄青霉素抗性基因，为了防止载体自身的干扰，使用Xba I和Bgl II对含有纳米抗体的酵母载体进行双酶切处理。以酶切产物为模板，使用pCold‑VHH‑F和pCold‑VHH‑R为引物进行PCR反应，使用无缝连接酶将PCR产物连接到pCold‑SUMO，具体步骤：pCold‑SUMO质粒在37℃条件下使用Kpn I酶切15 min，将PCR及酶切产物纯化后使用无缝连接酶，50℃条件下连接15 min，转化大肠杆菌DH5α中并涂布在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上。经过夜培养，挑取单克隆菌落，使用pCold‑f和pCold‑r为引物进行PCR检测，送至北京睿博兴科生物公司测序。对测序正确的大肠杆菌提取质粒，并转化BL21大肠杆菌感受态细胞，以备进行表达使用。

1.2.7 纳米抗体的原核表达及检测 取含有正确纳米抗体序列的大肠杆菌BL21单菌落，接种于20 mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600为0.4-0.6，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，调整温度为14℃低温诱导过夜，收集菌体，超声破碎后，取上清进行SDS‑PAGE分析。将超声破碎后的上清样品进行SDS‑PAGE电泳，将凝胶与大小适当的NC膜组装膜转移装置后置于冰内，60 V转膜40 min后调至120 V转膜30 min，将NC膜转移至含5%脱脂奶粉TBS封闭缓冲液放置于摇床上1 h后，将NC膜转移至含5%脱脂奶粉TBST溶液中，加入1 μL的鼠源Anti‑Strep Tag II单克隆抗体，放置于37℃恒温振荡器孵育1 h。用TBST溶液漂洗3遍，每次5 min，再将NC膜转移至含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，加入1 μL的HRP‑conjugated Goat Anti‑Mouse lgG二抗，放置于37℃恒温振荡器孵育30 min，用TBST溶液漂洗5遍，每次5 min，最后加入化学发光底物，使用BioRad超灵敏化学发光显色系统进行观察，以未进行低温诱导的样品为阴性对照。使用Strep‑tag II抗体磁珠对表达的表达蛋白进行纯化，纯化产物放置于4℃冰箱以备后续研究。

1.2.8 抗体的Western blot验证 为了验证制备的纳米抗体的效果，分别吸取2 μL FLAG多肽、NAP‑FLAG（融合FLAG标签的紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO‑FLAG（融合FLAG标签的紫花苜蓿MsUFO蛋白）、Tag标签（含有16种标签的蛋白质，P0059，上海碧云天生物技术有限公司）、NAP（紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO（紫花苜蓿MsUFO蛋白）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）、紫花苜蓿总蛋白样品点样于NC膜上，待样品晾干后，取5 μL转膜液覆盖住样品并再次晾干。以制备的纳米抗体为一抗，兔源HRP‑conjugated Anti‑Camelid VHH为二抗，进行Western blot检测。同时，以商品化的常规FLAG抗体为对照。

2 结果

2.1 酵母双杂交筛选结果

将构建好的pGBKT7‑FLAG转化至酵母Y2H Gold中，以FLAG标签作为诱饵蛋白，对实验室保存的含有FLAG纳米抗体的酵母文库进行筛选。通过酵母双杂交操作，共计筛选到52个阳性克隆（图1），通过PCR检测、测序分析、序列比对、合并重复序列，初步确定5个FLAG纳米抗体序列。

图1 FLAG标签酵母双杂交筛选Fig. 1 Yeast two-hybrid screening of FLAG tag

2.2 序列分析

基于测序结果，使用DNA Man软件，将DNA序列转化为蛋白质序列。通过序列分析发现，所获得的5个纳米抗体序列，长度为123-129 aa，符合驼源纳米抗体结构，其N端为驼源重链单域抗体（variable domain of heavy chain of heavy‑chain antibody,VHH）保守序列“QVQLQSEGG”，C端为“TQVTVSSA”或“TLVTVSSA”。所有序列均含有4个骨架区（frag‑ment region, FR）及3个抗原互补决定区（complemen‑tarity determining region, CDR）（图2）。

图2 FLAG标签纳米抗体序列及结构Fig. 2 Sequences and structures of FLAG-tag nanobody

2.3 酵母双杂交点对点验证

为了排除pGBD T7载体自身存在的假阳性干扰，需要对筛选的5个纳米抗体进行进一步验证。通过“点对点”分析显示（图3），5个含有纳米抗体的Y187酵母菌，能够分别与含有FLAG标签的Y2H Gold酵母菌结合，同时在SD/‑Trp‑Leu‑His‑Ade/X‑α-Gal/AbA能够正常生长，而且呈现蓝色；而仅含有pGBKT7空载的Y187酵母菌与含有FLAG标签的Y2H Gold酵母菌结合后，虽然能够在四缺培养基上生长，但是菌体却不能呈现蓝色。以上结果表明，所筛选的5个纳米抗体能够识别FLAG标签，但不能识别GAL4蛋白质的BD结构域。

图3 互作蛋白酵母双杂交验证Fig. 3 Yeast two-hybrid assay for protein-protein interaction

2.4 纳米抗体原核表达

将5个纳米抗体DNA序列连接至pCold‑SUMO载体并转化大肠杆菌，使用pCold‑F和pCold‑R为引物，进行PCR检测，结果（图4）显示，构建的5个载体均能扩增出与预期大小一致的PCR条带，初步显示原核表达载体构建成功。将检测阳性的大肠杆菌送至北京睿博兴科生物公司测序，结果显示用于所构建的5个原核表达载体序列正确，纳米抗体原核表达载体构建成功。

图4 纳米抗体原核表达载体PCR检测Fig. 4 PCR detection of prokaryotic expression vector for nanobodies

将5种纳米抗体的原核表达载体转化BL21大肠杆菌感受态细胞，经低温诱导过夜，收集菌体，超声破碎，取5 μL上清液进行SDS‑PAGE检测，经考马斯亮蓝染色，结果（图5）显示，仅有Nano‑FLAG6和Nano‑FLAG7成功表达出了可溶性纳米抗体蛋白。

图5 原核表达Fig. 5 Prokaryotic expression

为了确定蛋白表达成功，利用原核表达载体上的Strep‑tag II标签，对融合蛋白质进行Western blot分析，结果（图6）显示，Nano‑FLAG6和Nano‑FLAG7均能被检测出一条单一、清晰的杂交条带，而作为阴性对照的两个样品，没有任何杂交信号。以上结果表明，Nano‑FLAG6和Nano‑FLAG7均表达成功。

图6 Western blot检测Fig. 6 Western blot detection

2.5 表达抗体的Western blot验证

对不同的蛋白质样品进行Western blot检测，一抗为Nano‑FLAG6和Nano‑FLAG7原核表达的上清提取液，二抗为兔源HRP‑conjugated Anti‑Camelid VHH。检测结果（图7）显示，两种通过原核制备的纳米抗体，均能成功识别含有FLAG标签及含有FLAG标签的蛋白质，而作为阴性对照蛋白样品NAP蛋白质、UFO蛋白质、BSA以及紫花苜蓿全蛋白，均不能被制备的纳米抗体识别。该结果表明，成功制备了FLAG标签的纳米抗体，而且该纳米抗体具有极高的特异性。

图7 纳米抗体Western blot验证Fig. 7 Western blot validation of nanobodies

3 讨论

本研究成功通过酵母双杂交技术，从驼源纳米抗体文库中筛选出具有特异性识别FLAG标签蛋白的纳米抗体。经过表达、验证分析，获得了两株具有高特异性和亲和力的抗FLAG标签蛋白纳米抗体。通过“点对点”验证和原核表达Western blot分析，制备出含抗FLAG标签蛋白的纳米抗体，为FLAG标签的更广泛应用提供了理论参考和技术支持。

3.1 FLAG标签抗体

抗标签蛋白抗体作为研究相应融合蛋白的主要方法之一，具有很高的实用价值。然而，目前用于检测和纯化这些融合蛋白的商品化抗标签蛋白抗体种类较少、价格较高、稳定性较差、不易保存。因此，制备抗FLAG标签的特异性纳米抗体，可以满足融合蛋白实验研究的需求，发挥重要作用。本研究还可作为一种技术平台，为其他多种带标签蛋白纳米抗体的制备提供技术支持，并探讨不同方法制备抗FLAG标签纳米抗体的效果与作用。随着对FLAG短肽研究的深入和新型抗体的开发，FLAG标签的应用将会越来越广泛。

3.2 FLAG纳米抗体筛选

纳米抗体筛选技术包括噬菌体展示、酵母双杂交、mRNA展示、高通量测序和质谱分析等［2］。酵母双杂交技术是一种简便、高效、快速筛选蛋白质-蛋白质互作的方法［22］。2013年，Fu等［23］设计并构建了一个骆驼科动物单链抗体酵母双杂交文库，并成功筛选出具有高亲和力的抗猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）Cap蛋白的纳米抗体，该工作为研究猪圆环病毒2型的诊断和治疗提供新的工具和方法。Gao等［24］利用酵母双杂交技术筛选抗纽卡斯尔病毒（Newcastle disease virus, NDV）血凝素-神经氨酸酶（haemagglutinin‑neuraminidase,HN）蛋白的纳米抗体。本研究中，通过酵母文库筛选出特异性强、亲和力高的纳米抗体，并通过Western blot等方法进行检测和鉴定分析。通过酵母双杂交分析，从驼源中获得的5个纳米抗体序列，长度在123-129 aa之间，同时在N端和C端分别含有纳米抗体的保守序列；进一步的序列分析揭示了每个纳米抗体序列都含有4个骨架区和3个抗原互补决定区。骨架区和抗原互补决定区是纳米抗体与抗原结合的关键部位，骨架区提供了稳定的三维结构，而抗原互补决定区是抗体和抗原特异性结合的关键区域。表明了这些纳米抗体与常见驼源纳米抗体结构的一致性［25］，这些特征说明这些序列可能在抗体的识别和稳定性方面起到关键的作用，这些发现为理解驼源纳米抗体的结构和功能提供了新的视角，这对开发更有效的抗体疗法具有重要意义。

3.3 FLAG抗体融合表达

含标签融合蛋白是由目的蛋白和标签共同构成的蛋白嵌合体，具有许多优点，如有利于外源目的基因的有效翻译和表达、保持目的蛋白天然构象、避免重组蛋白降解、便于检测和纯化等［26］。常见的标签包括His标签、FLAG标签、Strep‑tag II标签、GST、MBP、Ub和SUMO等［27］。如姜茵等［28］利用GST融合基因表达系统表达了幽门螺杆菌Catalase融合蛋白，李志要等［29］利用猪源SUMO3标签蛋白可溶性表达猪腺病毒3型的Hexon基因高变区蛋白。SUMO标签除具有传统融合标签的特性外，还具有分子小、促进折叠、能被SUMO蛋白酶1专一性识别、对热和蛋白酶有很强的抗性、有利于保持目的蛋白的稳定性等优势［30］。Strep‑tag II系统的纯化条件比较宽泛，因为其在纯化过程中不依赖金属离子，Strep‑tag II也适合含金属离子蛋白质的纯化［31］。本研究利用含SUMO和Strep‑tag II标签的pCold‑SUMO载体进行原核表达，并利用原核表达载体上的Strep‑tag II标签对融合蛋白质进行了Western blot分析。

3.4 抗体效果验证

Western blot分析是进行蛋白质检测的重要手段，而外源蛋白质的可溶性表达，对于维持蛋白质的生物活性具有重要意义［32-33］。利用表达的纳米抗体的融合标签进行检测，通过分析发现，使用Strep‑tag II抗体，能够检测出6号和7号纳米抗体在上清中成功表达。这一结果为制备两种纳米抗体，并为进一步评估这些纳米抗体的功能提供了关键工具。然而，在后续的研究中仍需要深入探讨其他3种纳米抗体在原核表达系统中的表达效率较低的原因，并对Nano‑FLAG6和Nano‑FLAG7进行更多的功能性和疗效性研究。由于使用了Strep‑tag II标签，以及在进行纳米抗体纯化的时候购买的磁珠吸附能力及纯化效率低下等原因，导致仅仅富集了很少量的蛋白质，鉴于此情况，可以考虑后续将Strep‑tag II标签更换为其他标签，如6×His标签等，进行纳米抗体的大量制备及纯化。

制备的纳米抗体，需要进行抗体效果检测，Western blot是进行抗体检测的最简单、有效的方法［34］。利用成功制备的纳米抗体，并以商品化的FLAG标签抗体作为对照，通过WB来分析抗体效果。经过检测，在所有测试的样品中，只有含有FLAG标签的蛋白质被成功识别，而阴性对照组包括NAP蛋白质、UFO蛋白质、BSA以及紫花苜蓿全蛋白均未被识别，这一结果进一步确认了本研究所制备的纳米抗体对于FLAG标签的高度特异性。以上结果表明，通过筛选及制备纳米抗体，来进行蛋白质的Western blot检测是可行的。为了进一步检测抗体的效果，在未来工作中应对抗体进行其他研究，如免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（co‑inmunoprecipitation, CoIP）、染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）等。

总之，本研究为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供了重要的工具。通过酵母双杂交技术筛选、表达、验证分析，以及制备含抗FLAG标签蛋白的纳米抗体，为应用FLAG标签融合蛋白的研究提供了重要工具，并为进一步的FLAG标签应用提供了理论参考。此外，本研究为其他标签蛋白纳米抗体的制备提供了技术平台，有助于解决目前商品化抗标签蛋白抗体的种类有限、价格高昂、稳定性差和保存困难等问题，进一步拓宽FLAG标签技术在目的蛋白质分离纯化领域的应用前景。

4 结论

本研究通过酵母双杂交筛选方法，从骆源纳米抗体文库中发现了5个与FLAG标签蛋白互作的蛋白。这些互作蛋白在大肠杆菌表达菌株BL21中成功表达并得到正确的验证。其中，两个蛋白通过原核表达Western blot验证存在与FLAG标签蛋白的相互关系。这两种蛋白都能特异性识别FLAG标签蛋白，从而成功制备出含有抗FLAG标签蛋白的抗体。