酵母双杂交技术研究进展

刘国涛，张树宇，魏 凯*

（1.山东省滨州市畜牧兽医管理服务中心，山东 滨州 256600； 2.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）

酵母双杂交系统是研究活细胞内蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种强大且常用的分子生物学技术。该技术不仅能够检测细胞内稳定的蛋白互作，而且可以检测微弱的或者瞬时的蛋白相互作用。实验方法具有成本低，易操作，设计简单等一系列优点，在生物学实验中的应用十分广泛。酵母双杂交技术在众多生物学相关领域应用广泛且前景广阔。本文对酵母双杂交技术的基本原理、应用、发展前景等方面进行综述。

蛋白质在生命活动的的许多过程发挥着不可或缺的作用，如细胞间的信号转导，胞内物质的代谢及细菌病毒对细胞的入侵等。研究蛋白质相互作用对于人们深入了解预防传染病，靶向治疗多基因疾病有重要意义。酵母双杂交技术设计简单及其对微弱或短暂蛋白互作的检测能力使其在互作蛋白筛选过程中得到广泛应用。

1 酵母双杂交技术的基本原理

1986年Keegan等[1]发现了酵母细胞中的Gal4结构可结合特定的DNA序列（上游激活域，UAS），从而在半乳糖存在的情况下激活转录。1989年，Fields和Song通过描述一种基因系统来检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中直接的蛋白质-蛋白质相互作用，彻底改变了蛋白质相互作用分析[2]。Gal4有两个不同功能域即：N端DNA结合域（DNA-BD）和C端（转录）激活域（AD），两个单独的域均独立于另一个而维持其功能。在诱饵蛋白上加上BD结构域，在猎物蛋白上加上AD结构域，当诱饵和猎物结合时，BD和AD结构域在空间上相互接近，发挥转录因子的作用。DNA-BD结构域识别并结合GAL上的UAS（上游激活序列），AD结构域激活基因转录，从而使酵母特定基因如LzcZ、HIS3、MEL1、ABAr的表达，使酵母菌能够在特定的营养缺陷培养基上生长，同时水解培养基上的X-α-Gal[2]，使无色透明的X-α-Gal分解从而使菌落产生蓝斑，降低了假阳性率；也可通过AbA抗生素筛选报告基因的表达而在抗生素培养基上生长，提高了准确性。

2 酵母双杂交技术的应用

2.1 通过酵母双杂交技术筛选互作蛋白

从cDNA文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白是酵母双杂交技术最为重要的用途[3]。孙杰等[4]利用酵母双杂交统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选到三个与JNKK2相互作用的蛋白，为深入探究JNKK2在肝脏中的作用奠定了基础。Zhao等[5]通过酵母双杂交系统筛选和鉴定与环状泰勒虫半胱氨酸蛋白酶（TaCP）相互作用的宿主蛋白CRBN和Ppp4C，与CRBN和Ppp4C的相互作用表明TaCP可能参与调节信号传导途径和细胞增殖，这有助于了解环线虫与宿主细胞之间 的相互作用。Rana等[6]通过酵母双杂对人脑cDNA文库进行筛选，确定了7种宿主蛋白（CCDC130、CPNE6、POLR2C、MAPK9、EIF4A2、EIF1A1和EIF3I）作为CHIKV nsP2的假定相互作用子，为更深入的研究提供了基础。

2.2 通过酵母双杂交技术绘制蛋白质相互作用图谱

进入新的世纪，生命科学技术飞速发展，蛋白质成为了当前研究重点，绘制蛋白质互作图谱对研究生命活动调控有十分重要意义[7]。Xiang等[8]绘制了脊髓灰质炎病毒P3蛋白的完整蛋白连锁图，研究聚合酶3Dpol与VPg和3AB的遗传变异的相互作用。Teutschbein等[9]绘制结核分枝杆菌ESAT-6分泌系统1（ESX-1）的蛋白质连锁图，研究各种蛋白质之间的相互作用，以此作为药物开发的序幕。

2.3 通过酵母双杂交技术筛选药物靶标

在过去的30多年里，酵母双杂交系统已经有了越来越广泛的应用，在药物的发现和开发过程中也发挥着重要的作用。Lai等[10]利用酵母双杂交技术鉴定与弓形虫SAG1相互作用的宿主蛋白，发现富含赖氨酸的智人螺旋卷曲蛋白与SAG1相互作用，该蛋白可以作为疫苗研究中的潜在药物靶标。Pfefferle等[11]利用酵母双杂技术筛选鉴定免疫菌素（PPIA、PPIB、PPIH、PPIG、FKBP1A、FKBP1B）作为CoV非结构蛋白1（Nsp1）的相互作用伴侣，发现环孢菌素A（CspA）对亲环蛋白的抑制作用会阻止所有属CoV的复制，包括SARS-CoV，人CoV-229E和-NL-63，猫CoV以及禽类传染性支气管炎病毒。CspA的非免疫抑制衍生物可作为广泛的CoV抑制剂，应用于人和动物的CoV。

3 酵母双杂交优势及该技术存在的缺点

酵母双杂交系统已被证明是一种有用且灵敏高效的方法，不仅可以检测胞内稳定的相互作用蛋白，还可以检测微弱和短暂的蛋白相互作用。由于它也相对容易实现且价格便宜，因此酵母双杂交系统迅速成为检测蛋白质-蛋白质相互作用的首选系统。

3.1 酵母双杂交筛选互作蛋白的优势

以往的蛋白互作研究技术均是进行的体外实验，如免疫共沉淀、交联、亲和层析等，这些实验方法受外界因素干扰较大，且可能会和一些在空间上本不可能接触的蛋白互作，酵母双杂交技术因为是在活细胞内进行的，不受外界因素影响，同时也对瞬时存在的和不稳定的蛋白有较好的检测效果。

3.2 酵母双杂交技术存在的缺陷

酵母双杂交系统简单、易操作、多样性及高通量的能力使其成为最受欢迎的蛋白质互作分析筛选方法，但所有的酵母双杂交方法都存在假阳性和假阴性问题。（1）假阳性：某些诱饵蛋白或猎物蛋白具有激活转录的功能，猎物-BD融合基因与诱饵-AD融合基因无需相互接触就能启动转录系统，发生自激活现象从而导致假阳性结果。此外，一些蛋白可能会与其他蛋白形成蛋白复合体，激活报告基因，使酵母双杂产生假阳性。免疫共沉淀（CO-IP）和pull-down技术也用来验证酵母双杂的筛选出来的互作蛋白，经过这三种技术筛选出来的互作蛋白才有可能是目的蛋白。（2）假阴性：在酵母菌株中表达的蛋白质可能有毒性，从而抑制酵母的生长或其报告基因的表达。为了抑制背景表达而在培养基中添加的氨基三唑[12]（3-AT，3-Aminotriazole）也会对菌株产生一定毒性，一些较弱的蛋白质互作可能会被掩盖。此外，融合的酵母表达蛋白可能会引起空间位阻，从而阻碍蛋白相互作用，导致假阴性。

4 酵母双杂交技术的发展

4.1 基于膜系统的酵母双杂交（Membranebasedyeasttwo-hybridsystem）

在真核细胞中，很多蛋白质都是膜相关蛋白质，由于其疏水特性及不位于核内，因此经典的酵母双杂交系统很难用于检测蛋白互作。1998年Stagljar等[13]开发出了基于分裂泛素的遗传系统，用于分析体内膜蛋白之间的相互作用。膜酵母双杂交系统利用基于对体内重组泛素加工检测的泛素分裂法。在X和Y蛋白相互作用时，泛素重组，使蛋白裂解，释放转录因子从而启动报告基因的表达，该系统可用来检测膜蛋白间的相互作用。

4.2 酵母双杂交文库的高通量筛选

高通量筛选系统大大提高了文库筛选效率。Yachie等[14]设计的BFG-Y2H系统利用Cre重组酶通过条码标记每个诱饵和猎物基因，通过高通量测序同时识别所有的相互作用蛋白，此外BFG-Y2H系统还可检测自激活诱饵的相互作用。Yu等[15]开发出的新方法可仅使用10ng文库并通过15个循环扩增后进行高通量测序，较传统的方法能够评估插入的基因数、基因丰度等指标。

5 展望

酵母双杂交技术建立30多年以来，虽然存在假阳性、假阴性等缺陷，但仍得到了广泛的应用及相应的发展，酵母单杂（yeast one-hybrid）、酵母三杂（Yeast Three-Hybrid）等技术也相继问世其快速、高效等特点受到学界广泛认可，酵母杂交技术对生物学研究及药物的研发功不可没，必将在今后的研究中发挥更重要的作用。