一测多评法同时测定菊花配方颗粒中8个成分的含量

赵剑锋，宋宗华*，刘静

1.国家药典委员会，北京 100061；

2.中国食品药品检定研究院，北京 102629

2021 年4 月，国家药品监督管理局颁布首批160 个中药配方颗粒国家标准[1]，其中包括菊花配方颗粒国家标准。菊花配方颗粒为菊花经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。菊花为菊科菊属多年生草本植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，有散风清热、平肝明目、清热解毒的功能，临床上用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒[2]。现代研究表明，菊花中主要有黄酮类、挥发油、苯丙素类、萜类、氨基酸等化学成分，其中黄酮和苯丙素类化合物为菊花的主要药效成分[3]。目前，菊花及其配方颗粒国家标准均以木犀草苷、绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为质量控制指标。除了上述3 个成分，其他黄酮类和苯丙素类成分也是菊花配方颗粒发挥作用的重要物质基础。近年来，一测多评法（QAMS）在中药整体质量控制领域被广泛应用，在中药同类化学成分含量测定方面日渐成熟[4-10]。本研究采用QAMS，以木犀草苷为内标物，通过建立其与绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的相对校正因子（RCF），同时计算出其他待测成分的含量，实现多个成分的同步含量测定，用于菊花配方颗粒的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

LC-30AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；H-Class 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；KQ-300DA 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 型纯水仪（美国Millipore 公司）；AE-240 型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

对照品绿原酸（批号：110753-202119，纯度：96.3%）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111782-201807，纯度：94.3%）、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111894-202104，纯度：95.1%）、木犀草苷（批号：111720-201807，纯度：96.6%）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批号：111968-201602，纯度：97.7%）、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111717-201402，纯度：94.5%）、芦丁（批号：100080-202012，纯度：91.6%）均由中国食品药品检定研究院提供；3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Y-069-170516，纯度＞98.0%）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；水为纯化水。

7批菊花配方颗粒样品信息见表1。

表1 7批菊花配方颗粒样品信息

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液制备 精密称取绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，加70%甲醇制成质量浓度分别为1.070、1.114、1.080、1.088、1.019、0.378、1.177、1.310 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量至20 mL量瓶中，加70%甲醇制成质量浓度分别为53.50、55.70、54.00、54.40、50.95、37.80、58.85、65.50 µg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（300 W，40 kHz）40 min，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～10 min，10%～20%A；10～36 min，20%A；36～40 min，20%～90%A）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL；检测波长：348 nm。色谱图见图1。

图1 混合对照品及菊花配方颗粒样品高效液相色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液，按照2.2 项下色谱条件进行测定。分别以各对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程，结果见表2。结果表明8个成分在一定质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

表2 菊花配方颗粒中8个成分的线性关系

2.3.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μL，按2.2 项下色谱条件测定，连续进样6 次，记录峰面积。结果绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD 分别为0.30%、0.80%、0.19%、0.18%、0.15%、0.12%、0.32%、0.08%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取按2.1.2 项下方法制备的供试品（JHPF-1）溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按2.2 项下色谱条件测定各成分的峰面积，结果绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD 分别为1.17%、1.24%、0.96%、1.12%、0.98%、1.32%、1.08%、1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品（JHPF-1）6份，每份约0.2 g，研细，精密称定，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2 项下色谱条件测定各成分的峰面积，计算含量。结果样品中绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸平均质量分数分别为0.457%、0.143%、0.461%、0.918%、0.332%、0.492%、0.721%、0.712%，含量的RSD分别为1.85%、1.43%、2.18%、1.25%、2.28%、1.05%、2.09%、1.49%，表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的菊花配方颗粒（JHPF-1）6 份，每份约0.1 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.1.1 项下单一对照品绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸储备液适量，按2.1.2 项下方法制备供试溶液，按2.2 项下色谱条件测定，记录峰面积，分别计算回收率。8 个成分平均加样回收率分别为98.4%、97.1%、96.7%、99.4%、102.1%、97.2%、98.2%、98.2%，回收率的RSD分别为2.9%、2.9%、2.7%、1.9%、1.8%、2.6%、1.8%、2.4%。

2.4 RCF计算

精密吸取2.1.1 项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按2.2 项色谱条件进样测定，以木犀草苷为内标物，按公式（1）计算其他7 个成分的相对校正因子（f）。

式中Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分质量浓度；As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，结果见表3。

表3 菊花配方颗粒7个待测成分RCF

2.5 RCF耐用性考察

2.5.1 高效液相色谱仪和色谱柱 在Waters HClass、LC-30AD 2 种高效液相色谱仪考察了Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 根不同色谱柱对RCF 的影响，各成分在不同色谱仪和不同色谱柱上的RCF 的RSD 均小于5%，表明不同色谱仪和不同色谱柱所得的RCF 差异无统计学意义，见表4。

表4 不同仪器和色谱柱对菊花配方颗粒7个待测成分RCF的影响

2.5.2 柱温 采用岛津LC_30AD 高效液相色谱仪、Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。考察不同柱温（25、30、35 ℃）对RCF 影响，结果显示，RCF差异无统计学意义，RSD＜5%，见表5。

表5 不同柱温对菊花配方颗粒7个待测成分RCF的影响

2.5.3 流动相流速 考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）对RCF 的影响，精密吸取混合对照品溶液2 μL 注入液相色谱仪中，记录峰面积。各成分RCF 的RSD 均小于5%，表明不同流速对各成分RCF影响差异无统计学意义，见表6。

表6 不同流动相流速对菊花配方颗粒7个待测成分RCF的影响

2.6 色谱峰定位

采用相对保留时间法，以木犀草苷为基准峰，在不同色谱柱下对该参数进行考察。结果表明，不同色谱柱下各成分间的相对保留值波动较小，RSD均小于5%，见表7。

表7 不同色谱柱下菊花配方颗粒7个待测成分的相对保留时间

2.7 QAMS与外标法（ESM）的结果比较

分别取7批样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2 项下色谱条件进行测定，采用ESM和QAMS计算菊花配方颗粒中绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量，见表8。2种方法所得到的8个成分含量基本一致，RSD＜5%，QAMS可以代替ESM进行多成分质量评价。

表8 ESM和QAMS测定菊花配方颗粒8个成分质量分数（n=3）mg·g-1

3 讨论

本研究参考了菊花配方颗粒国家标准含量测定方法，采用70%甲醇对样品进行超声处理，检测波长选择为348 nm，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液。参考已报道的菊花药材多成分含量测定方法[11-13]，选择Agilent TC-C18色谱柱，在此基础上对梯度洗脱条件进行优化，结果表明本方法的8 个成分得到基线分离。

QAMS 可以通过单个成分实现多个成分的同步测定，木犀草苷对照品保留时间处于中间位置，比较容易获取，并且在配方颗粒中的含量相对稳定，因此选择其作为参照物。通过测定，其他7 个成分的相对保留时间和RCF 重复性良好。采用ESM 和QAMS对7批菊花配方颗粒中8个成分的含量测定结果进行比较分析，采用RSD 比较2种方法的准确性。2 种方法对同一样品的测定结果之间的RSD 均在3%以内，表明2 种测定方法所得结果具有较好的重复性。

通过比较4家企业生产的7批菊花配方颗粒中8个成分的含量，发现绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸3 个成分含量均在法定标准限度内，并且重复性较好。但是不同企业生产的配方颗粒中1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量差异较为明显，可能为生产原料和工艺所致。

4 结论

本研究所建立的QAMS 同时测定了菊花配方颗粒中8 个成分的含量的方法准确、稳定、重复性好，在降低分析检测成本的同时，可以更全面地反映菊花配方颗粒内在质量，对于完善菊花配方颗粒国家标准具有一定参考价值。