含灯盏花中成药DNA提取及其分子鉴定△

朱高倩，王丽，殷子喻，符德欢*

1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；

2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

灯盏细辛（灯盏花）为菊科植物短葶飞蓬Erigeron brevicapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草，是灯盏生脉胶囊等成药制剂的重要原料[1]。但是由于灯盏花资源的大量利用，其药材时有混淆物种[2]。这些物种在性味归经、功能主治、化学成分、药理活性上有很大的区别[1,3-4]，从而可能影响中成药的质量控制。目前，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）记载的含灯盏花中成药鉴别很难从中成药追溯到入药的基原物种[1]。虽然很多植物科属都已获得相对稳定的DNA条形码序列[5]，但由于从药用植物到药材再到中成药经历了重重工艺[6]，使DNA 条形码技术应用受限。目前，中成药含某一药味[7-8]或多个药味[9-11]的分子鉴定技术逐渐有了新突破。灯盏花植物虽已进行了内转录间隔区2（ITS2）、matK位点序列分析研究[5,12]，但要将DNA 条形码综合应用到中成药的原料物种溯源鉴别尚面临着如何有效地提取出含灯盏花中成药DNA 及选择合适的聚合酶链式反应（PCR）扩增标记等关键问题。鉴于不同物种组配的中成药DNA 提取方法及获取相应的DNA 条形码的序列存在不同程度的差异，本研究基于中药材DNA提取及PCR扩增的前期文献报道[7-8]，以灯盏花对照药材作为对照，对市场上常见含灯盏花的固体剂型（片、分散片、胶囊）中成药进行不同DNA 提取方法的比较，并采用DNA 条形码技术常用ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 个位点通用引物对提取的DNA 进行PCR 扩增，以探索出一套适用于含灯盏花固体剂型中成药DNA 条形码技术鉴定方法，为含灯盏花中成药的原料药材物种溯源提供技术支持，从而对其质量控制提供技术参考。

1 材料

1.1 仪器

6331 型PCR 仪、5424R 型小型台式冷冻高速离心机均购于Eppendorf 公司；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；ZF-258 型全自动凝胶成像分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；LT1002E 型电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）；NTT-2000 型恒温水浴锅（东京理化器械株式会社）；NanoDrop Lite型超微量核酸定量仪（Thermo 公司）；Advantage A10 Milli-Q型超纯水发生器（默克密理博公司）。

1.2 试剂

2×十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）缓冲液 [含2% CTAB、1.4 mol·L-1NaCl、1 mol·L-1Tris-HCl、0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）]、三氯甲烷-异戊醇（24∶1）、3 mol·L-1乙酸钠；异丙醇、乙醇均购自利安隆博华医药化学有限公司；甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；β-巯基乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；BIOWEST G-10 琼脂糖（上海贝晶生物技术有限公司）；花青素核酸染料 [生工生物工程（上海）股份有限公司]；2×EsTaqMasterMix（Dye）（康为世纪生物科技股份有限公司）；超纯水为自制。

1.3 样品

灯盏细辛（灯盏花）对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121269-201103）；含灯盏花中成药（包括2种单味中成药和1种复方中成药）具体信息见表1，留样保存于云南省药物研究所。

表1 3种含灯盏花中成药信息

2 方法

2.1 灯盏花对照药材DNA提取

将灯盏花对照药材研磨成细粉（过四号筛）。取灯盏花药材粉末约200 mg 置于2 mL 离心管，加入65 ℃预热的2×CTAB 缓冲液1000 μL，振摇混匀，置于恒温水浴锅裂解2 h，每隔20 min 振荡1 次。水浴完成后，10 000 r·min-1（离心半径为8.5 cm）离心10 min，吸取上清液置于新的2 mL 离心管中。加入等体积三氯甲烷-异戊醇（24∶1）后振摇5 min 并充分混匀，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），取上清液置于新的2 mL 离心管中。加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇，置于-20 ℃沉淀2 h 后，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），弃上清液。所得的沉淀置于37 ℃干燥箱1 h，使得乙醇充分挥发；待乙醇充分挥干后，加无菌水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃备用。以上方法提取6个重复。

2.2 含灯盏花中成药DNA提取

采用下述4种方法提取含灯盏花中成药DNA。

方法一在经典CTAB 植物总DNA 提取方法的基础上进行改良，具体步骤：1）片剂去除中成药的包衣，研细；胶囊直接去除胶囊壳后研细；2）称取中成药粉末约200 mg 于2 mL 的离心管内，加入65 ℃预热的2×CTAB缓冲液1000 μL和β-巯基乙醇20 μL，振摇，置于65 ℃水浴锅中裂解2 h，期间每隔20 min振荡1次；3）水浴完成后，10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8.5 cm），吸取上清液置于新的2 mL离心管中；4）加入三氯甲烷-异戊醇（24∶1）1000 μL后振摇5 min并充分混匀，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），取上清液另置于新的2 mL离心管；5）加入三氯甲烷-异戊醇（24∶1）1000 μL后振摇5 min并充分混匀，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），取上清液另置于新的1.5 mL离心管加入同体积-20 ℃下的异丙醇，于-20 ℃下沉淀2 h，置于12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），弃上清液；6）沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇挥发完毕后加无菌超纯水500 μL 溶解，保存于-20 ℃或4 ℃备用。

方法二在方法一的基础上增加了DNA 纯化步骤，具体步骤：方法一的步骤1）至5）完成后，沉淀，用无菌超纯水600 μL 溶解，加入乙醇1200 μL及3 mol·L-1乙酸钠溶液60 μL，在离心管中混匀；于-20 ℃静置1 h后，置于12 000 r·min-1离心15 min，该步骤重复2次；沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇挥发完毕后加无菌超纯水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃备用。

方法三是在CTAB 法的基础上，参考程春松等[7]的方法，具体步骤：1）片剂去除中成药的包衣，研细；胶囊直接去除胶囊壳后研细；2）称取中成药粉末约50 mg 于2 mL 的离心管内（同一个样取4 份）；3）每份加入65 ℃预热的2×CTAB 缓冲液625 μL 和β-巯基乙醇25 μL，振摇，置于65 ℃水浴锅中裂解2 h，期间每隔15 min 振荡1 次；在8000 r·min-1离 心5 min（离心半径为8.5 cm）；4）取上清液600 μL加入70%甲醇溶液1250 μL，振摇，-20 ℃沉淀1 h，8000 r·min-1离心5 min（离心半径为8.5 cm），取沉淀加CTAB提取缓冲液150 μL及β-巯基乙醇4 μL，于65 ℃裂解20 min，期间振荡，将4 份合成1 管；5）加入三氯甲烷-异戊醇（24∶1）1000 μL后振摇5 min并充分混匀，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），取上清液另置于新的1.5 mL 离心管加入同体积-20 ℃的异丙醇，-20 ℃沉淀2 h，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径8.5 cm），弃上清液；6）沉淀于37 ℃干燥1 h，待乙醇挥发完毕后加无菌超纯水500 μL溶解，保存于-20 ℃或4 ℃备用。

方法四在方法三的基础上增加了DNA 纯化步骤，具体步骤：方法三的步骤1）至5）完成后，沉淀，用无菌超纯水600 μL 溶解，加入乙醇1200 μL及3 mol·L-1乙酸钠溶液60 μL，在离心管中混匀；于-20 ℃静置1 h后，置于12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为8.5 cm），该步骤重复2 次；沉淀放于37 ℃干燥箱1 h，待乙醇挥发完毕后加无菌超纯水500 μL 溶解，保存在-20 ℃或4 ℃的冰箱低温保存备用。

以上每个方法每个样品12个重复。提取的DNA质量浓度采用SPSS 18.0 的One-way ANOVA 进行方差分析，并用Duncan 多重比较法进行差异显著性比较，结果以（±s）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.3 灯盏花对照药材及含灯盏花中成药的PCR扩增

使用ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5、matKXF/matK5R、matK3F/matK1R、psbA/trnH、rbcL1F/rbcL724R 进行灯盏花对照药材及含灯盏花中成药DNA 的PCR 扩增，引物序列见表2。上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为10 μL，包括2×EsTaqMasterMix（Dye）5 μL、正反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、DNA 样品溶液约100 ng、无菌超纯水根据DNA 样品添加量进行调整，补足至最终的PCR 反应体系。根据已设定的PCR 扩增的程序进行扩增 [ITS 位点：94 ℃预变性5 min；进入循环，循环内94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共34个循环；72 ℃终延伸10 min，10 ℃保存。psbA-trnH位点：95 ℃预变性4 min；进入循环，循环内94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃终延伸10 min，10 ℃保存。matK、rbcL位点：94 ℃预变性5 min；进入循环，循环内94 ℃变性1 min，48 ℃退火45 s；72 ℃延伸100 s，共34 个循环；72 ℃终延伸7 min，10 ℃保存]；PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表2 灯盏花对照药材及含灯盏花中成药PCR扩增引物序列

2.4 灯盏花对照药材及含灯盏花中成药的DNA 序列分析

将成功获得的PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，PCR 扩增引物作为测序引物，采用BioEdit去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域，序列方向与PCR 扩增正向引物方向一致，获得不同位点相应的DNA序列。

2.5 灯盏花对照药材及含灯盏花中成药的系统发育分析

从美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载飞蓬属不同物种的matK序列，对获得的序列用软件MEGA 5.0 比对并进行系统发育等分析。构建邻接（NJ）系统发育树，利用Bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。

3 结果与分析

3.1 DNA提取方法的比较

微量紫外-可见分光光度检测结果显示（表3），灯盏花对照药材所获得的DNA 质量浓度为（205.00±42.14）ng·μL-1，A260nm/A280nm为1.99±0.02，说明DNA 质量较佳；含灯盏花中成药采用4 种方法均能获得DNA，各样品所获得的DNA 质量浓度均呈方法一（CTAB+β-巯基乙醇）＞方法二（CTAB+β-巯基乙醇+乙醇/乙酸钠纯化）＞方法三（CTAB+β-巯基乙醇+甲醇沉淀纯化）＞方法四（CTAB+β-巯基乙醇+乙醇/乙酸钠纯化+甲醇沉淀纯化），其中方法一提取的DNA 质量浓度显著高于其他方法，其A260nm/A280nm均小于1.60，说明存在大量有机物、多糖或蛋白质等杂质污染，4 种方法之间的A260nm/A280nm无明显规律，说明乙醇/乙酸钠纯化或甲醇沉淀纯化对含灯盏花中成药DNA 纯度的提升无明显影响。在每种DNA 提取方法中，DNA 质量浓度又均呈灯盏生脉胶囊＞益脉康分散片＞益脉康片，说明中成药中的处方和制法也对DNA提取有影响。

表3 灯盏花对照药材和含灯盏花中成药的纯度和质量浓度

3.2 PCR扩增位点的选择

利用ITS位点（ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5）、matK位点（matKXF/matK5R、matK3F/matK1R）、psbA-trnH位点（psbA/trnH）、rbcL位 点（rbcL1F/rbcL724R）4个位点6对引物对灯盏花对照药材及不同方法提取的中成药样品DNA进行PCR扩增。结果表明（图1），灯盏花对照药材能成功扩增所有位点，除了psbA-trnH位点（psbA/trnH）扩增为有非特异扩增的条带不适合产物直接测序，其他均为单一条带可进行产物直接测序；但在中成药DNA 中4 个位点6 对引物的PCR 扩增则呈现不同程度的差异：总体上以方法一和方法二提取的中成药样品DNA 进行PCR 反应的成功率和扩增产物浓度相对较高；psbA-trnH位点（psbA/trnH）扩增条带的带型在4 个方法提取出的中成药DNA 中扩增不完全一致，为单一条带或有非特异扩增条带，扩增特异性不佳；ITS 位点（ITS4/ITS5）在部分中成药样品中未能成功扩增；ITS 位 点（ITS2F/ITS2R）、matK位点（matKXF/matK5R 和matK3F/matK1R）、rbcL位点（rbcL1F/rbcL724R）均能扩增出单一条带且与灯盏花对照药材为相同位置，以matK位点2 对引物的PCR产物浓度最适合后续测序。

图1 含灯盏花中成药DNA的PCR扩增（部分）

3.3 matK序列对含灯盏花中成药的分子鉴定

鉴于有的植物中存在内生真菌[13]，中成药制备、包装、运输等过程中可能会引入微生物污染[14]，以及复方DNA 提取存在其他处方药味DNA 干扰，为了明确含灯盏花中成药与灯盏花对照药材的PCR 扩增产物序列是否相同，在保证PCR 扩增成功率和扩增浓度的基础上，选择本研究中PCR 扩增成功率和扩增浓度最佳的matK位点制备含灯盏花中成药分子鉴定所需测序样品。对各样品中获得的matK位点（2 对引物）PCR 产物进行直接测序，进一步分析matK位点对含灯盏花中成药的分子鉴定效果。结果表明，所有样品均测序成功，且在matK片段序列（GGGATAGTCT……GTATACACAG 共 计670 bp）与灯盏花对照药材及NCBI 灯盏花（GenBank 登录号：NC043882.1、MN449489.1）相同区段序列同源性为100%；基于该序列构建的系统发育树结果表明（图2），3 个含灯盏花中成药与灯盏花对照药材、NCBI中的灯盏花聚为1支，且能与飞蓬属其他31个种鉴别开，证明matK位点（2 对引物）对含灯盏花中成药进行分子鉴定是有效的。

图2 中成药中灯盏花matK序列与飞蓬属植物的鉴别

4 讨论

4.1 含灯盏花中成药DNA提取方法比较

中成药一般是饮片或提取物经过特定的工艺加工而成，有原粉末入药（如丸剂、散剂等）和药材经过深加工（如液体制剂、颗粒剂等）两大类[15]，在此过程中其DNA 多已降解，并引入了各类辅料，使得中成药DNA 的提取比新鲜样品或中药材干品更困难。虽然常用DNA 提取的方法有CTAB 法、十二烷基硫酸钠（SDS）法等[16]，但相较而言，CTAB 法更广泛地适用于植物类中药材的DNA 提取，近年来，改良的CTAB 法被应用于中药材不同物种、品种、药用部位的DNA 提取[17-19]。分子生物学技术应用于中成药的处方药味物种溯源过程中，传统DNA条形码技术改良应用[7-8,20]和新型技术应用开发[21-23]均须以获取高质量DNA 为鉴定基础。目前CTAB法[7-8]、SDS 法[24]、DNA 试剂盒法[9,22]、磁珠试剂盒法[25]常用于固体剂型的中成药DNA 提取；乙醇沉淀法[26]则多用于液体剂型的中成药DNA 提取。在含灯盏花中成药制剂过程中，其制法工艺多将中药饮片提取浸膏进行制剂（如本研究中采用的灯盏生脉胶囊）或直接以提取自中药材的有效化合物进行制剂（如灯盏花素片等）[1]，其中，灯盏细辛浸膏工艺一般为醇提[1]，而化合物灯盏花素的制备工艺一般是在醇提浸膏的基础上进行大孔吸附树脂洗脱和酸沉工艺纯化[27]，可见含灯盏花中成药制法过程涉及醇、酸等有机试剂，对DNA 的破坏较为严重。由于本研究中成药样品加工过程中添加的辅料为淀粉等多糖类物质，前人在提取此类中成药DNA 的方法探索中多针对此类物质的去除开展，多基于能较好地去除多糖类物质的CTAB 法进行改良[28]。因此，本研究基于CTAB 法，结合文献报道方法进行比较，结果表明，4种CTAB改良方法均能获得不同质量浓度的DNA，说明CTAB 法确实适用于提取含灯盏花中成药的DNA；本研究中4 个方法提取中成药的纯度虽无明显差异，但A260nm/A280nm均小于1.60，DNA 质量与灯盏花对照药材相差甚远，其原因可能与本研究的中成药样品所涉及的处方药味和制备工艺有密切关系，灯盏生脉胶囊涉及4 个药味（灯盏细辛、人参、五味子、麦冬）、益脉康分散片和益脉康片涉及1 个提取物（灯盏细辛浸膏）均经过乙醇提取、添加淀粉等步骤，这些过程同时将有效化学成分、核酸、蛋白质、多糖等物质混合提取，由于本研究采用的DNA 沉淀剂也为乙醇，导致制备工艺过程与DNA 混合的蛋白质和多糖很难去除干净，从而影响了中成药DNA 的纯度。本研究中的CTAB 改良方法一或方法二提取的DNA 质量浓度明显高于采用甲醇沉淀纯化的方法三或方法四，甲醇沉淀的纯化结果不如人参类中成药[7]、当归类中成药[8]，其原因可能是甲醇沉淀纯化不适用于含灯盏花中成药的DNA 纯度提升。另外，本研究中的每种中成药DNA 提取方法中，DNA 质量浓度均呈现灯盏生脉胶囊＞益脉康分散片＞益脉康片，差异有统计学意义，其原因可能与其处方药味量、剂型差异较大密切相关，灯盏生脉胶囊处方（1000 个单位）中含灯盏细辛3000 g，灯盏细辛浸膏片处方（1000 个单位）中含灯盏细辛浸膏160 g[1,29]。这说明含灯盏花中成药的DNA 提取不仅与提取方法有关，还与中成药本身的处方、制法、剂型相关。

4.2 含灯盏花中成药的分子鉴定位点选择

根据《中国药典》2020 年版（四部）“9107 中药材DNA 条形码分子鉴定法指导原则”，分子鉴定步骤包含DNA 提取、PCR 扩增和测序[30]。分子鉴定位点的选择与该位点PCR 扩增效率、测序效率和鉴别效率有密切关系。DNA 条形码鉴定技术应用于植物类中药材基原物种鉴定中，常用的通用条形码有ITS、psbA-trnH、matK、rbcL，4 个DNA 候选条形码片段的引物通用性、序列质量和物种分辨率等综合分析结果表明，ITS 的物种分辨率显著高于rbcL+matK条形码组合，ITS2 也具有较高的鉴定效率[13]。其中ITS/ITS2 和psbA-trnH在《中国药典》2020 年版（四部）被推荐为药用植物通用条形码序列[30]。已有研究者在飞蓬属植物（一般以植物鲜品为样品）中获得ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 个位点的序列，研究表明均有不同程度的鉴别效率[31-33]，而针对灯盏花植物则应用ITS2 和matK进行鉴别，明确了这2 个位点对灯盏花有鉴别效果[12,34]。由于ITS、psbA-trnH、matK、rbcL4 个位点均有不同的通用引物，匹配每个位点不同区段的通用引物通用性各有差异，因此，本研究采用ITS、psbA-trnH、matK、rbcL这4 个位点常用的通用引物首先对DNA 质量较佳的灯盏花对照药材进行PCR 扩增以验证其通用性，结果表明灯盏花对照药材中能成功扩增浓度较高的产物，除了psbA位点（psbA/trnH）扩增有非特异扩增条带不适合产物直接测序，其他均为单一条带可进行产物直接测序，说明6 个引物在灯盏花这个物种的PCR 中通用性较好，在本研究的PCR 反应体系和反应条件下，引物psbA/trnH 对灯盏花对照药材PCR 的特异性可能要比其他3 个位点5 对引物稍弱一些。与灯盏花对照药材相比，中成药DNA 纯度相对不理想（A260nm/A280nm＜1.60），4 个位点6 对引物对提取DNA 质量浓度最佳的方法一获得的中成药样品DNA 中PCR 成功率和扩增产物浓度相对较高；PCR 成功率方面除了ITS 位点的1 对引物ITS4/ITS5存在未扩出PCR 产物的情况，其他引物均获得PCR产物；特异性方面除了引物psbA/trnH，其他3 个位点5 对引物获得的条带均为单一条带且与灯盏花对照药材相同位置；扩增产物浓度以matK位点的2 对引物（matKXF/matK5R 和matK3F/matK1R）扩增的产物浓度与灯盏花对照药材最为接近，最适合直接产物测序，其次是rbcL位点的1 对引物（rbcL1F/rbcL724R）和psbA-trnH位点的1对引物（psbA/trnH），最后是ITS 位点的2 对引物（ITS2F/ITS2R、ITS4/ITS5）。虽然在PCR 扩增过程中，DNA 模板质量、PCR 扩增引物及反应条件等因素可能会影响PCR 成功率[35]，但本研究中中成药的PCR 扩增与灯盏花对照药材在相同反应体系、反应条件下进行，两者主要差异在于DNA 模板的质量，因此，分析中成药与灯盏花对照药材的PCR 扩增产物浓度的差异可能与DNA 模板质量密切相关，即中成药DNA 中残留的有机物、多糖或蛋白质等杂质较多，对PCR扩增结果产生了不同程度的影响，这种影响在不同位点的不同引物之间存在差异，其中对matK位点的2 对引物影响最小，而对ITS 位点2 对引物影响较大，且2对引物之间差异也很大。

由于物种可能存在内生真菌[13]，中成药制备、包装、运输等过程中也可能引入微生物污染[14]，复方中还有可能受到其他处方药味DNA 干扰，加之，与叶绿体位点如matK、psbA-trnH、rbcL相比，ITS现在所用PCR 引物在植物和真菌间具有很高的通用性[36]，结合本研究中ITS 位点2 对引物在中成药中PCR 扩增表现不佳，因此选择叶绿体基因matK位点的2 对引物在保证PCR 扩增成功率和扩增浓度的基础上开展测序，以明确中成药的PCR 扩增产物为灯盏花的目的片段，结果表明含灯盏花中成药均能测序成功，灯盏生脉胶囊、益脉康片、益脉康分散片扩增的产物序列与对照药材、NCBI 灯盏花matK序列同源性100%，与飞蓬属的其他31 个种能通过系统发育树鉴别开，其中灯盏生脉胶囊虽为复方，但其测序结果依然为灯盏花，而不受其他药味的影响，其原因可能是，灯盏生脉胶囊处方药味中灯盏细辛量达3000 g，占处方药味总量的1/2 以上[30]。进一步也说明传统DNA 条形码技术“DNA 提取+PCR 扩增+测序”方法除了鉴别含灯盏花单方中成药，也可用于含灯盏花占比较大的复方中成药中的灯盏花物种鉴别，该方法步骤已流程化，简单易操作且耗费低廉，适于推广应用。

含灯盏花中成药品种、制剂类型、辅料添加多样，本研究仅对灯盏花单方和含灯盏花大比例的小复方进行DNA 条形码分子鉴定法应用探索，筛选出提取步骤、耗试剂相对较少且提取效率较高的DNA提取方法（CTAB 改良方法一）提取的含灯盏花中成药DNA，能够满足后续matK位点通用引物（matK3F/matK1R、matKXF/matK5R）1 次PCR 扩增和测序，从而实现灯盏花原料药材的鉴别，为建立和完善灯盏花中成药的质量控制、评价标准提供参考。但也需要注意的是，对于含灯盏花中成药的其他处方，如灯盏花在其处方中的占比远小于或等于其他药味，或是采用提取化合物形式制剂如灯盏花素片等。本研究筛选的DNA条形码技术“DNA提取+PCR扩增+测序”方法的应用也需进一步验证后方可知其效果。另外，ITS2 作为灯盏花另一个明确具有鉴别效果的位点[22]，在本研究中ITS 位点的引物ITS2F/ITS2R 在灯盏花对照药材中均能获得可用于测序的PCR 产物，在相同反应体系、反应条件下中成药的1 次PCR 虽能成功扩增但获得的产物浓度不甚理想，可从优化反应体系和反应条件、利用二次PCR 扩增以增加产物浓度、重新设计针对灯盏花ITS/ITS2 位点的特异引物或是继续探寻含灯盏花中成药DNA 纯化的方法等方向进行探索，以提升PCR产物浓度，使测序顺利进行。