一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和DNA条形码特征比较分析及鉴别方法研究△

张文娟，李明华，程显隆，段庆梓，魏锋，华桦，赵军宁*，马双成*

1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；

2.成都市食品检验研究院，四川 成都 611135；

3.四川省中医药转化医学中心，四川 成都 610041；

4.四川省中医药科学院，四川 成都 610041

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis（BerK.）Sacc.是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要分布于3200～5000 m 高寒地区的高山草甸和峡谷，为贵细传统中药材[1-4]。由于近年来过度采挖，其野生资源急剧减少，市场价格畸高，其他外观相似的虫草冒充冬虫夏草的现象比较普遍，常见伪品一般来源于虫草属，如古尼虫草、亚香棒虫草等。伪品的有效性及安全性尚缺乏全面深入的研究，因此有必要建立相应的真伪鉴别方法[5-9]。

基于DNA 的分析方法客观准确，目前被广泛用于虫草和其他中药材的鉴定和真伪鉴别中。虫草一般由真菌和蝙蝠蛾幼虫两部分组成，因此相关的鉴别方法研究也多基于这两部分的不同。真菌的DNA 分析多基于内转录间隔区（ITS）[10-13]，而蝙蝠蛾幼虫则多基于虫体的线粒体基因细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）[7,14]。可以采用DNA 条形码鉴定法对虫草进行鉴定或者鉴别，分析不同虫草的亲缘关系等；或者采用聚合酶链式反应（PCR）、PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）鉴别法，通过设计专属性引物或者依靠专属性限制性内切酶位点，达到鉴别的目的。

本课题组发现了一种产自四川的特殊虫草，外观跟冬虫夏草非常相似，通常被当作冬虫夏草使用，但是其微性状、真菌ITS 序列及虫体COⅠ序列与冬虫夏草都具有明显的区别，因此认为不应盲目将该虫草当作冬虫夏草使用，需要与冬虫夏草进行鉴别。本研究建立了基于XhoⅠ限制性内切酶的PCR-RFLP鉴别法，可以实现冬虫夏草与该特殊虫草的客观准确鉴别，从而为提升冬虫夏草质量控制水平提供有效手段。

1 材料

1.1 样品

虫草样品经中国食品药品检定研究院标本馆张继主任药师鉴定，样品详细信息见表1。

表1 虫草样品信息

1.2 仪器

VERITI型PCR仪（Thermo Fisher公司）；AB135-S型分析天平（Mettler-Toledo 公司）；EPS-301 型电泳仪（Amersham 公司）；DMC4500 型体视荧光显微镜（Leica 公司）；Gel Doc XR+型全自动凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；MM400型球磨仪（Retsch公司）。

1.3 试剂

快捷型植物基因组提取试剂盒（批号：DP321，天根生化科技有限公司）；ExTaq（批号：DRR100B，TaKaRa 公司）；dNTP Mixture（批号：N0447）、XhoⅠ（批号：R0146）均购于Biolabs公司；GelRed（批号：41003，Biotium 公司）；ITS 引物（上游：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，下游：5'-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3'，深圳华大基因科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品处理与DNA提取

分别取样品的子座和虫体部分，用酒精棉球将表面擦拭干净，晾干；用球磨仪磨成极细粉末，称取粉末样品约30 mg 备用。基因组DNA 提取按照试剂盒说明书进行操作。

2.2 PCR扩增及序列分析

PCR 反应条件：预变性94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、30 s（35 个循环）；最后延伸72 ℃、5 min。PCR 反应体系25 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，TaqDNA 聚合酶0.2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.6 μL，反应缓冲液2.5 μL，灭菌超纯水20.3 μL。

PCR 样品送至深圳华大基因科技有限公司进行Sanger 法测序。采用CodonCode Aligner 进行序列拼接、剪切和限制性内切酶位点分析；采用MEGA 5.0 进行多序列比对分析，构建邻接（NJ）系统进化树。

2.3 XhoⅠ酶切反应

反应体系为20 μL，包括PCR产物10 μL、XhoⅠ0.5 μL、反应缓冲液2 μL、灭菌去离子水（ddH2O）7.5 μL。反应条件为37 ℃、15 min。

2.4 琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像

使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压5 V·cm-1，约40 min；电泳结束后使用凝胶成像仪拍照并保存结果。

3 结果

3.1 冬虫夏草和特殊虫草的性状特征比较

2 种虫草均由子座部分和虫体部分组成。与冬虫夏草相比，特殊虫草的子座部分较短，虫体较小（图1）。通过体视显微镜观察，特殊虫草头部的颜色与冬虫夏草明显不同，冬虫夏草为黄褐色（图2A），特殊虫草为红褐色（图2B），提示两者的宿主蝙蝠蛾昆虫存在不同。

图1 特殊虫草与冬虫夏草的性状特征

图2 体式显微镜成像显示冬虫夏草和特殊虫草头部颜色

3.2 冬虫夏草和特殊虫草寄生真菌的ITS序列差异

通过对寄生真菌的ITS 序列进行比对分析，冬虫夏草和特殊虫草存在7 个差异位点（总长562 bp）（图3A）；基于ITS 序列的NJ 系统进化树分析显示，冬虫夏草与特殊虫草各聚为1 支；两者汇聚后又与伪品虫草聚为1支（图3B）。表明特殊虫草的寄生真菌与冬虫夏草亲缘关系较近，与常见伪品关系较远。

图3 冬虫夏草和特殊虫草的真菌ITS序列分析

3.3 冬虫夏草和特殊虫草宿主COⅠ序列差异

对宿主蝙蝠蛾幼虫的COⅠ序列进行比对分析，冬虫夏草和特殊虫草宿主的COⅠ序列存在56 个差异位点（总长659 bp，图4A）；基于COⅠ序列的NJ系统进化树分析显示，特殊虫草与常见伪品虫草首先聚为1 支，然后再与冬虫夏草汇聚，表明特殊虫草的宿主蝙蝠蛾昆虫与一些常见伪品具有更近的亲缘关系（图4B）。

图4 冬虫夏草和特殊虫草的虫体COⅠ序列分析

3.4 基于真菌ITS 序列限制性内切酶位点差异的PCR-RFLP鉴别

用ITS 的通用引物扩增得到冬虫夏草和特殊虫草的ITS 区，并对该区域进行测序和序列分析。通过进行限制性内切酶图谱的比较分析，发现冬虫夏草在该区域有且只有1 个XhoⅠ的限制性内切酶位点，而特殊虫草在该区域不存在这一位点（图5A）。琼脂糖凝胶电泳图显示，冬虫夏草ITS 扩增产物通过XhoⅠ的限制性内切酶作用后被切割为2 个片段，而特殊虫草的ITS扩增产物不会被XhoⅠ切割，酶切前后电泳条带的大小及数量保持一致（图5B）。该方法可以用于鉴别冬虫夏草和此类特殊虫草。

图5 冬虫夏草和特殊虫草ITS序列XhoⅠ限制性内切酶位点的PCR-RFLP鉴别

4 讨论

冬虫夏草是一种名贵的中药材，具有多种有益人体健康的化学成分，应用历史悠久。随着人们对健康的重视程度越来越高，对冬虫夏草的需求也越来越多。然而冬虫夏草以野生品为主，资源匮乏，近年来市场价格不断攀升，各种伪品和替代品应运而生，真假难辨，主要伪品来源有古尼虫草、亚香棒虫草、新疆虫草等。伪品和替代品与冬虫夏草的成分有一定差异，需要进行严格区分以保证冬虫夏草的安全性和有效性，以及维护市场的公平竞争秩序。通过特异性PCR 或者PCR 结合限制性内切酶的方法，可以有效鉴别冬虫夏草和相关伪品及替代品。在运用DNA 分子鉴定方法进行鉴别检验时，本课题组发现了一种特殊的“冬虫夏草”，其与某些伪品一样不能被限制性内切酶XhoⅠ酶切，而以往本课题组检测的多批次冬虫夏草均具有这一酶切位点。

进一步研究发现，这种特殊虫草的明显外部特征为复眼颜色偏红、虫体较小；寄生真菌的ITS 序列与典型冬虫夏草比对，发现多个变异位点，但与几种常见伪品相比，跟典型冬虫夏草具有更近的亲缘关系；宿主蝙蝠蛾昆虫的COⅠ序列与典型冬虫夏草比对，发现56 个变异位点，与常见伪品更为近缘。以上结果表明，特殊虫草的真菌部分与典型冬虫夏草最为接近，而虫体部分与一些伪品更为相似。经调研，这种虫草一般发现于四川低海拔地区，通常以较低的价格作为冬虫夏草出售。然而，鉴于特殊虫草与典型冬虫夏草的真菌子座及宿主蝙蝠蛾昆虫部分均有明显不同，是否能够将其作为冬虫夏草使用，还应结合地方用药历史考察和物质基础分析[15-18]，必要时进行生物活性和安全性方面的比较评价研究[19-20]，从而确保冬虫夏草用药的有效性和安全性。

此外，本研究基于特殊虫草在ITS 区域不存在XhoⅠ酶切位点建立了一种基于PCR-RFLP的鉴别方法，为准确鉴别特殊虫草与典型冬虫夏草提供了客观简便的工具，为冬虫夏草的精准质控提供了技术储备。