miR-205 通过JAK2/STAT3 信号通路影响三阴性乳腺癌细胞的体外转移活性

张军,李杰,李杏,李鸽姿,赵崇如,陈嘉丽,彭大伟,张天莹

中南大学湘雅二医院深圳医院(深圳市前海蛇口自贸区医院) 甲状腺乳腺外科 广东省深圳市,518101

miRNA 是约22 个核苷酸的小型非编码RNA,通过转录后靶向mRNA 显示出重要的调控作用[5]。miRNA 在TNBC 中发挥着广泛的致癌功能,包括细胞增殖、凋亡、迁移、转移、和血管生成[6]。例如,miR-551-3p 在TNBC 中异常表达,抑制miR-551-3p 表达可减少肿瘤生长和转移;miRNA-27b 通过靶向丙酮酸脱氢酶复合体成分X (pyruvate dehydrogenase complex component X,PDHX)减少线粒体氧化并促进细胞外酸化,导致乳腺癌进展[7-8]。最新研究发现,在TNBC 中,miR-205 表达异常。miR-205 是一种重要的肿瘤抑制因子,其异位表达可以使耐药乳腺癌细胞对阿霉素和紫杉醇敏感[9]。然而,miR-205 在TNBC 进展中的作用尚未有过系统性报道。

既往研究发现,酪氨酸激酶2/信号传导与活化转录因子3 (janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3) 异常激活与TNBC 发展密切相关,抑制JAK2/STAT3 通路激活能够有效阻止TNBC 恶化[10]。然而其在TNBC中的详细调控机制尚未报道,因此本研究拟探究miR-205 与JAK2/STAT3 在TNBC 发展中的作用关系,以期为TNBC 的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 (中国科学院细胞资源中心);Lipofectamine 2000 (日本Takara公司);胎牛血清(美国Gibco 公司);pGL4 载体(北京启研生物科技有限公司);Transwell 小室(美国赛默飞公司);Annexin V/PI 试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);RIPA 裂解液(北京索莱宝生物科技有限公司);miR-205 mimic,miR NC,pcDNA3.1 NC 和pcDNA3.1 JAK2 质粒(上海安迪生物科技有限公司);anti-JAK2 (英国Abcam公司);anti-GAPDH (美国CST 公司);anti-STAT3(美国abcam 公司)。25 对人TNBC 组织及相邻正常组织由本院提供,在取得组织样本之前,所有患者均已阅读并签署知情同意书。

1.2 细胞培养

MDA-MB-231 细胞在含10 % FBS 的RPMI-1640 培养基中培养,培养环境为37 ℃5 % CO2。取处于对数生长期的MDA-MB-231 细胞用于实验,首先将细胞分为4 组: miR NC+pcDNA3.1 NC 组,miR-205 mimic +pcDNA3.1 NC 组,miR NC +pcDNA3.1 JAK2 组和miR-205 mimic +pcDNA3.1 JAK2组。参照说明书使用Lipofectamine 2000 将4 类质粒分布转染到对应实验组。

1.3 Western 印迹检测蛋白表达变化

细胞和肿瘤组织在蛋白裂解液缓冲液中匀浆后,并在4 ℃下12 000 r/min 离心10 min 后,蛋白质浓度由考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定。对等量的总蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中分离,并将其电转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5 %脱脂牛奶将封闭1 h,然后用特定的一级和二级抗体孵育。通过增强化学发光试剂盒进行蛋白显影,使用软件Image J 10.0 分析蛋白灰度值。

1.4 RNA 分离和实时荧光定量PCR 分析基因表达

使用Trizol 试剂从细胞中分离出总RNA。使用PrimeScript RT 试剂盒进行逆转录。最后使用SYBR Green 试剂在7900HT 系统 (Applied Biosystems,美国) 上通过实时荧光定量PCR 扩增DNA,使用2-ΔΔCt方法计算表达水平。

引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 细胞集落形成实验分析MDA-MB-231 细胞生长能力

将MDA-MB-231 细胞以300 个/孔接种在6 孔板中,进行过夜培养,次日进行转染。然后再培养10～14 d 后,用4 %福尔马林固定细胞,并用0.1 %结晶紫染色。用Image J 软件计算每个孔中的细胞集落数。

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1.6 流式细胞术凋亡分析MDA-MB-231 细胞凋亡率

将不同实验组细胞接种在6 孔板中进行过夜培养,转染完成48 h 后,收集细胞,用预冷的PBS 洗涤2 次,并用FITC 结合的Annexin V 和PI 在结合缓冲液中双重染色15 min。使用Accuri C6 流式细胞仪(BD,Franklin Lakes,NJ,USA) 分析细胞凋亡情况。

1.7 细胞划痕实验分析MDA-MB-231 细胞迁移能力

将MDA-MB-231 细胞接种在6 孔板中,培养24 h 后按实验组进行转染。次日使用100 μL 枪头划痕,使每条划痕具有相同宽度,完成后在显微镜下记录拍照,放入培养箱继续培养24 h 后拿出培养皿在显微镜下记录拍照划痕宽度,然后使用Image J 软件统计MDA-MB-231 细胞迁移情况。

1.8 Transwell 实验分析MDA-MB-231 细胞侵袭能力

在无血清RPMI-1640 培养基下,将有转染完成后的MDA-MB-231 细胞接种在Matrigel 涂层的小室的上室。将含有15 %血清的RPMI-1640 培养基加入下室。24 h 后,在显微镜下观察到侵入下室的细胞,随后用结晶紫染色,使用Image J 软件统计MDA-MB-231 细胞侵袭情况。

1.9 荧光素酶报告基因实验分析miR-205 与JAK2 的作用关系

将JAK2 的野生型(WT) 或突变区域序列克隆到空的pRLTK Renilla 荧光素酶载体中。将不同的TNBC 细胞接种到96 孔板中,转染WT、突变体和空载体以及50 nmol/L miR-205 mimic 和阴性对照至MDA-MB-231 细胞。6 h 后,更换培养基,并根据说明在Promega 荧光素酶检测系统进行双荧光素酶报告基因实验。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 miR-205 和JAK 在TNBC 组织中的表达情况

RT-qPCR 实验结果显示,和癌旁组织比较,miR-205 在人TNBC 组织中表达显著降低 (P＜0.05,图1A)。

图1 miR-205 和JAK 在TNBC 组织中的表达情况

另外,Western 印迹实验结果显示,和癌旁组织比较,JAK2 在人TNBC 组织中表达显著升高(P＜0.05,图1B)。

2.2 在MDA-MB-231 细胞中JAK2 是miR-205 的直接靶点

在TargetScan 上分析miR-205 的靶向基因,分析结果显示JAK2 mRNA 序列的3′-UTR 区域有miR-205 结合位点(图2A)。将miR-205 可能的结合位点克隆到pRL-TK 载体进行验证。荧光素酶报告基因实验结果发现,与miR NC 比较,miR-205转染细胞后,具有WT 结合位点的JAK2 的荧光素酶活性受到抑制(P＜0.05,图2B)。Western 印迹实验进一步验证,miR-205 mimic 组JAK2 和STAT3表达水平降低(P＜0.05,图2C)。

2.3 miR-205 与JAK2 对MDA-MB-231 细胞集落形成和凋亡率的影响

统计不同实验组细胞集落形成数量发现,与miR NC+pcDNA3.1 NC 组比较,miR-205 过表达后能够抑制MDA-MB-231 细胞集落形成且促进其凋亡,然而过表达JAK2 后能够增加MDA-MB-231细胞集落形成且减少其凋亡。

另外,与miR NC+pcDNA3.1 JAK2 组比较,miR-205 过表达能够逆转过表达JAK2 带来的效果(P＜0.05,图3)。

图3 miR-205 与JAK2 对MDA-MB-231 细胞集落形成和凋亡率的影响

2.4 miR-205 与JAK2 对MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力的影响

通过划痕实验发现,与miR NC+pcDNA3.1 NC 组比较,miR-205 过表达后能够抑制MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力,然而过表达JAK2 后能够增加MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力(P＜0.05,图4)。

图4 miR-205 与JAK2 对MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力的影响

另外,与miR NC+pcDNA3.1 JAK2 组比较,miR-205 过表达能够逆转过表达JAK2 带来的效果(P＜0.05,图4)。

2.5 miR-205 对JAK2/STAT3 途径的影响

通过Western 印迹实验对不同实验组JAK2/STAT3 蛋白表达进行分析,结果显示,与miR NC +pcDNA3.1 NC 组比较,miR-205 过表达后能够抑制MDA-MB-231 细胞JAK2/STAT3 蛋白表达,然而过表达JAK2 后能够增加MDA-MB-231 细胞能够增加JAK2/STAT3 蛋白表达。另外,与miR NC+pcDNA3.1 JAK2 组比较,miR-205 过表达能够逆转过表达JAK2 导致的JAK2/STAT3 蛋白表达增加(P＜0.05,图5)。

图5 miR-205 对JAK2/STAT3 途径的影响

3 讨论

miR-205 为非编码RNA,不转化为蛋白质,但它积极参与各种癌症的生理和病理过程,甚至驱动特定细胞的生物反应[11-12]。其中,miRNAs 是可以改变癌基因和肿瘤抑制基因的表达,并通过与靶基因的3′-UTR 结合来扰乱细胞功能[13]。胃癌、前列腺癌、胰腺癌,甚至乳腺癌中都存在miR-205 表达降低的现象[14-15]。有研究发现,miR-205 能够通过抑制血管内皮生长因子A 和成纤维细胞生长因子2来恢复乳腺癌细胞对化疗的化疗敏感性[16]。由于miR-205 已被报道在多种肿瘤发展过程中具有抑癌作用[17],并且其通常出现表达异常在TNBC 组织中,然而其详细作用机制尚未清楚。本研究发现,在TNBC 组织中,miR-205 表达水平降低。通过在细胞实验中过表达miR-205 后,三阴性乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移能力均受到抑制,结果提示miR-205 能够抑制三阴性乳腺癌细胞恶性生物学过程,而这一结论正好符合miR-205 在其他肿瘤中的规律。

既往研究发现,JAK2/STAT3 信号通路在乳腺癌的增殖、存活和耐药性中起着至关重要的作用,例如,IL-6 能够通过激活JAK2/STAT3 信号通路进而促进乳腺癌EMT 的发生和转移[18]。研究表明,使用阿霉素治疗三阴性乳腺癌时,由于后期出现耐药现象导致治疗效果不佳。研究发现,阿霉素可以激活STAT3,这可能是TNBC 临床治疗期间产生耐药性的原因[19]。因此,有效抑制JAK2/STAT3 有助于提高疗效。本研究发现,JAK2 在人TNBC 组织中表达异常增加。此外,在细胞实验中发现过表达JAK2 后,三阴性乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移能力提升,这一现象符合他人的研究结论。同时,本研究发现miR-205 能够靶向抑制JAK2 表达,并且JAK2 的促癌作用也受到抑制。

综上所述,本研究发现,miR-205 能够靶向调控JAK2/STAT3 途径,进而抑制三阴性乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移,并同时促进三阴性乳腺癌细胞凋亡。因此,靶向作用miR-205 和JAK2/STAT3途径可能是三阴性乳腺癌潜在的新疗法。