异氟醚对高糖诱导的H9C2 心肌细胞损伤及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

周翔 ,许明山 ,祝波 ,郑其山 ,郑育秀

1海南省东方市人民医院麻醉科 海南省东方市,572600 2海南医学院第二附属医院麻醉科 海口市,570311

糖尿病性心肌病是一种糖尿病诱发的病理生理状况,可导致心力衰竭,其早期特征是左心室舒张功能障碍、左心室肥大等,晚期会出现明显的收缩功能降低、心力衰竭[1-2]。这种情况的发病机制是多因素的,目前认为高血糖是主要促进因素[3]。尽管在过去10 年中糖尿病性心肌病的临床研究数量呈指数增长,但尚未就糖尿病性心肌病或糖尿病相关心衰的最有效预防或治疗方法达成共识。异氟醚是常用的卤代类吸入麻醉药,在临床上已被广泛使用[4]。越来越多的证据表明,除了用作麻醉剂外,异氟醚还具有非麻醉生理特性如抗炎症、抗氧化和抗细胞凋亡[5]。异氟醚通过激活脂多糖刺激的巨噬细胞中的HO-1 通路来引发其抗炎活性[6]。磷脂酰肌醇3 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B,AKT) 信号通路通过控制靶蛋白磷酸化参与细胞的生长、增殖等过程,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR) 作为该信号通路的下游靶基因之一,与细胞的生长过程密切相关[7]。但异氟醚能否通过调节PI3K/Akt/mTOR 通路影响高糖诱导的H9C2 心肌细胞损伤尚未报道。本实验旨在探讨异氟醚对高糖诱导的H9C2 心肌细胞损伤及PI3K/Akt/mTOR 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

中国科学院生命科学研究院提供H9C2 心肌细胞。

1.2 主要试剂及仪器

异氟醚(上海瀚思化工有限公司);CCK-8 试剂盒 (默沙克生物科技有限公司);PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂-LY294002、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 (Sigma 公司);p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 一抗(Santa Cruz 公司);Beclin1、p-mTOR、mTOR 一抗(Cell Signaling Technology 公司);B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白(B lymphocytoma-2 associated protein,Bax) 一抗(Abcam 公司)。Fax-20100 酶标仪 (美国INStat 公司);流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.3 细胞培养与分组

用含10 %胎牛血清的DMEM 细胞培养液培养H9C2 心肌细胞,放置于37 ℃,5 % CO2培养箱内进行常规传代培养,2 d 换一次培养基。取对数生长期细胞,根据前期预实验结果及参考文献[8-9]进行细胞处理和分组: 对照组(未处理的H9C2 心肌细胞)、高糖组(35 mmol/L 葡萄糖);在高糖组的基础上,分别加入异氟醚、PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂-LY294002 处理,标记为异氟醚低浓度组(1 %异氟醚)、异氟醚高浓度组(2 %异氟醚)、异氟醚高浓度+LY294002 组(2 % 异氟醚+50 μmol/L LY294002 共同处理)。

1.4 CCK-8 法检测各组细胞增殖情况

收集处理24 h 后的各组细胞,以2 ×105个/mL 接种至96 孔板中,严格按照试剂盒说明书进行检测,向每孔中加入10 % CCK-8 溶液,2 h 后,在波长为450 nm 处,用酶标仪检测吸光度(A),按照细胞增殖率(%)=(实验组A450nm-空白组A450nm)/ (对照组A450nm-空白组A450nm) ×100 %,得出细胞增殖率。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞,PBS 洗涤两次后,加入胰酶消化,悬浮后的细胞,加入5 μL Annecin Ⅴ-FITC,避光孵育20 min 后,加入10 μL PI 溶液混匀孵育5 min,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 透射电子显微镜观察各组细胞自噬情况

收集各组细胞,加入质量分数为2.5 %的戊二醛溶液、1 %锇酸溶液进行过夜固定,加入浓度不同的丙酮溶液进行梯度脱水,然后分别进行渗透、包埋、切片和染色等常规操作步骤,最后于透射电子显微镜下观察各组细胞自噬形态。

1.7 Western 印迹检测相关蛋白表达水平

以RIPA 裂解缓冲液裂解各组细胞,离心后收集总蛋白,利用BCA 试剂盒对各组蛋白质定量,然后以12 % SDS-PAGE 凝胶电泳分离,转膜、封闭。加入稀释 (1 ∶2 000) 的p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Beclin1、p-mTOR、mTOR、Bax 一 抗,4 ℃过夜孵育,然后加入稀释(1∶5 000) 的二抗室温孵育2 h,显色、拍照,以GAPDH 为内参,ImageJ 软件分析各个蛋白的灰度值。

1.8 统计分析

SPSS 软件(22.0 版) 用于统计分析实验数据,以表示所有数据,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两组间比较采用SNK-q检验;P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异氟醚对各组H9C2 细胞增殖率的影响

高糖组H9C2 细胞增殖率较对照组显著下降(P＜0.05);与高糖组相比,异氟醚低、高浓度组H9C2 细胞增殖率显著增加(P＜0.05);与异氟醚高浓度组相比,异氟醚高浓度+LY294002 组H9C2细胞增殖率显著下降(P＜0.05,表1)。

表1 比较异氟醚对各组细胞增殖率的影响(,n=6)

表1 比较异氟醚对各组细胞增殖率的影响(,n=6)

与对照组比较,aP＜0.05;与高糖组比较,bP＜0.05;与异氟醚低浓度组相比,c P＜0.05;与异氟醚高浓度组相比,d P＜0.05

2.2 异氟醚对各组H9C2 细胞凋亡率的影响

高糖组H9C2 细胞凋亡率较对照组显著增加(P＜0.05);与高糖组相比,异氟醚低、高浓度组H9C2 细胞凋亡率显著下降(P＜0.05);与异氟醚高浓度组相比,异氟醚高浓度+LY294002 组H9C2细胞凋亡率显著增加(P＜0.05) (图1、表2)。

表2 异氟醚对各组细胞凋亡率的影响(,n=6)

表2 异氟醚对各组细胞凋亡率的影响(,n=6)

与对照组相比,aP＜0.05;与高糖组相比,bP＜0.05;与异氟醚低浓度组相比,c P＜0.05;与异氟醚高浓度组相比,d P＜0.05

2.3 透射电子显微镜观察各组细胞自噬形态

高糖组明显可见形成的自噬小体;与高糖组相比,异氟醚低、高浓度组H9C2 细胞中自噬小体逐渐减少;与异氟醚高浓度组相比,异氟醚高浓度+LY294002 组H9C2 细胞中自噬小体显著增加(图2)。

图2 各组细胞自噬形态(×10 000)

2.4 异氟醚对各组H9C2 细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白的影响

高糖组H9C2 细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 表达水平较对照组显著下降(P＜0.05);与高糖组相比,异氟醚低、高浓度组H9C2 细胞 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 显著增加(P＜0.05);与异氟醚高浓度组相比,异氟醚高浓度+LY294002 组H9C2 细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 显著下降(P＜0.05,表3、图3)。

图3 H9C2 细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白Western 印迹图

表3 各组H9C2 细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白的比较(,n=6)

表3 各组H9C2 细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白的比较(,n=6)

与对照组相比,aP＜0.05;与高糖组相比,bP＜0.05;与异氟醚低浓度组相比,cP＜0.05;与异氟醚高浓度组相比,dP＜0.05

2.5 异氟醚对各组H9C2 细胞中自噬、凋亡相关蛋白的影响

高糖组H9C2 细胞Bax、Beclin1 较对照组显著增加(P＜0.05);与高糖组相比,异氟醚低、高浓度组H9C2 细胞Bax、Beclin1 显著下降 (P＜0.05);与异氟醚高浓度组相比,异氟醚高浓度+LY294002 组H9C2 细胞Bax、Beclin1 显著增加(P＜0.05,图4、表4)。

图4 H9C2 细胞中Bax、Beclin1 蛋白Western 印迹图

表4 各组H9C2 细胞中Bax、Beclin1 蛋白的比较(,n=6)

与对照组相比,aP＜0.05;与高糖组相比,bP＜0.05;与异氟醚低浓度组相比,cP＜0.05;与异氟醚高浓度组相比,dP＜0.05

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病患者在没有高血压心脏病、冠状动脉疾病和瓣膜性心脏病的情况下,产生的微血管病变、心肌间质增生、心肌代谢紊乱等特异性疾病[10]。研究表明氧化应激、线粒体功能障碍、炎性反应、糖尿病微血管病、自噬、心肌代谢异常和细胞凋亡与糖尿病心肌病的发展有关[11]。糖尿病心肌病已被确认为糖尿病患者住院和死亡的主要原因。尽管糖尿病分子病因学取得了进展,但目前的治疗方法未能预防糖尿病患者产生的特异性疾病,因此探寻新治疗策略显得尤为重要[12]。

异氟醚属于一种卤代烃类吸入麻醉剂,在临床上已被广泛使用。在宫颈癌U14 细胞研究中发现异氟醚可以抑制宫颈癌细胞增殖,诱发其凋亡[13]。在氯化钾诱导的老年2 型糖尿病大鼠模型中,异氟醚以剂量依赖性方式抑制KCl 诱导的主动脉血管收缩[14]。Lin 等[15]研究发现异氟醚预处理抑制了视网膜中NLRP3 炎性体的活化,可以在中风引起的糖尿病视网膜损伤中提供实质性的视网膜保护。葡萄糖毒性引起的胰腺β 细胞损伤是2 型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM) 的一个重要因素,内质网应激诱导的细胞凋亡是导致β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗的原因,研究发现异氟醚通过抑制内质网应激减轻葡萄糖诱导的大鼠胰岛β 细胞凋亡,可能作为糖尿病的潜在疗法[16]。但异氟醚对于糖尿病心肌病的研究尚未报道,本研究发现高糖组细胞增殖率显著降低,细胞凋亡率显著增加。经不同浓度的异氟醚处理后,细胞增殖率显著增加,细胞凋亡率显著降低,提示异氟醚可能抑制高糖诱导的H9C2 心肌细胞凋亡,避免细胞受损,但具体机制需进一步探索。

研究发现PI3K/AKT 通路参与心肌细胞的保护,mTOR 作为PI3K/AKT 通路的下游靶因子,参与细胞生长、蛋白质合成等多种生物学过程,其中饥饿和缺氧、生长因子等均是其上游刺激因素,另外mTOR 通路与脂质合成、自噬、线粒体功能等密切相关[17-18]。在高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤中[19],通过PI3K/Akt/mTOR 信号转导通路的活化可以抑制自噬,减少细胞受损。另外,赵瑞翔等[20]研究发现在高糖诱导的H9C2 心肌细胞中,下调miR-1 可以活化PI3K/Akt/mTOR 通路,减少细胞自噬。本研究发现高糖诱导的H9C2 心肌细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 显著降低,自噬及凋亡相关蛋白(Bax、Beclin1) 表达显著增加,自噬小体增加。经异氟醚处理后,增加了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 水平,降低了自噬及凋亡相关蛋白表达,表明异氟醚可以通过激活PI3K/Akt/mTOR 通路,降低细胞自噬和凋亡,改善细胞损伤。为进一步验证该猜想,本实验引入PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂-LY294002,结果发现,LY294002 可以消弱异氟醚对高糖诱导的H9C2 心肌细胞损伤的保护作用。

综上所述,异氟醚通过激活PI3K/Akt/mTOR通路可以抑制细胞凋亡、自噬,改善高糖诱导的H9C2 心肌细胞受损,为治疗糖尿病心肌病提供潜在方案,但后续仍需通过动物实验进行深入研究。