加味独活寄生合剂对膝骨关节炎兔骨代谢的影响

郭俊刚，邝 涛

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以进行性膝关节软骨退变、膝关节滑膜炎症、膝关节间隙变窄、膝关节软骨下骨代谢异常等病理表现为主的骨关节退行性疾病，临床症状早期以疼痛为主，这种疼痛多在休息时减轻，夜晚或活动后加重，同时还伴有一定程度的关节肿胀、皮温升高、活动障碍，后期则可能出现关节畸形而导致残废［1］。相关研究发现，软骨下骨的骨代谢失衡，尤其是骨吸收的增强在关节软骨发生改变之前就已经发生，膝关节软骨下骨的改变与重塑可能是KOA发病的始动因素［2-3］，因此，从调控软骨下骨代谢异常和骨重塑出发来治疗KOA 已逐渐成为研究热点［4］。加味独活寄生合剂是湖南中医药大学第一附属医院骨伤科的协定处方，以《备急千金药方》中的独活寄生汤为基础加减化裁而来，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿的作用［5］。曾凡等［6］研究表明，加味独活寄生合剂可以降低患者关节内相关炎症因子水平，改善关节活动度。本研究在前期研究的基础上，从软骨下骨代谢的角度进一步探索加味独活寄生合剂治疗膝骨关节炎的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 3 月龄成年健康雌性新西兰大白兔，体质量（2.25±0.25）kg，购自湖南太平生物科技有限公司，实验动物许可编号：SYXK（湘）2020-0005。实验中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，所有动物适应性喂养（室温25 ℃，湿度60%，食物水源充足）1周后开始实验。

1.2 药品与试剂 加味独活寄生合剂由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，批号20180625，每瓶250 ml，每毫升含生药0.664 g。木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，批号G8430，规格：每瓶25 g。水合氯醛购自青岛宇龙海藻有限公司，批号H37022673，规格：每瓶500 g。硫酸氨基葡萄糖购自山西同达药业有限公司，批号H20090316，规格：每粒0.25 mg。0.9%氯化钠注射液购自湖南康源制药有限公司，批号H20103461，规格：每瓶100 ml。兔Ⅰ型胶原C 端肽（CTX-Ⅰ）试剂盒（货号：ml036844）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）试剂盒（货号：ml027225）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）试剂盒（货号：ml036768）均购自上海酶联生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 动物分组与造模 适应性喂养结束后，将32 只雌性新西兰大白兔随机分为4 组：空白组、模型组、中药组、阳性对照组，每组8 只。除空白组外，余组均参照文献［7］方法进行造模，模型组、中药组、阳性对照组的新西兰大白兔于实验前禁食12 h，先用棉签蘸取碘伏于兔耳缘静脉周围画圈消毒2 次，用注射器抽取5%水合氯醛溶液（用量为75 mg/kg）沿兔耳缘静脉缓慢注射，边注射边观察兔的呼吸频率和心率。深度麻醉后，用棉签蘸取碘伏在兔右膝关节附近消毒2次，接下来用注射器将0.5 ml 1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液缓慢注入兔膝关节腔内，每隔3 d 注射1 次，共注射3次。在造模过程中，每日上午10点、下午4点将新西兰大白兔放置于空旷场地驱赶，强迫活动30 min。空白组注射等量0.9%氯化钠溶液，其余操作与其他组相同。

2.2 给药 参考《药理实验方法学》［8］附录中的动物与人的等效剂量折算表，换算出新西兰大白兔的给药剂量。中药组灌胃给予加味独活寄生合剂，剂量为3.237 g/kg；阳性对照组灌胃给予硫酸氨基葡萄糖，剂量为0.048 g/kg；模型组、空白组灌胃给予0.9%氯化钠溶液；各组灌胃量均为10 ml/kg。灌胃从造模结束后第1 d开始，共灌胃8周。

2.3 骨代谢标志物检测 灌胃结束后，沿兔耳缘静脉注射5%水合氯醛溶液（用量为75 mg/kg），麻醉成功后取腹主动脉血10 ml放入抗凝管中，在室温下静置1 h，通过离心机离心分离上血清，将标本置于-80 ℃的环境中保存，按照试剂盒说明进行ELISA检测。

2.4 统计学分析 采用SPSS 23.0 软件对实验数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐性用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，多组间进行比较采用LSD分析；若方差不齐则采用Tamhance’s T2 法分析。不符合正态分布的计量资料则使用非参数检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组动物一般情况 造模前，各组新西兰大白兔精神状态良好，灵活敏捷，体重无明显变化，进食、饮水正常，双膝关节皮温正常，皮色正常。造模第10 d，空白组新西兰大白兔与造模前无明显差别，模型组、中药组、阳性对照组新西兰大白兔则表现为精神倦怠，不喜活动，食欲稍减退，查看膝关节发现右侧膝关节较左侧明显肿胀，皮温升高，局部青紫，被动活动其右膝关节时可诱发疼痛反射。灌胃8 周后，与模型组相比，中药组和阳性对照组大白兔的食欲、精神状态、膝关节肿胀程度均有所改善。

3.2 各组新西兰大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b 水平比较 见表1。结果显示，与空白组比较，模型组的CTX-Ⅰ、TRACP-5b水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组与阳性对照组的CTX-Ⅰ、TRACP-5b 水平显著降低（P＜0.05）；中药组与阳性对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表1 各组新西兰大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b水平比较（）

表1 各组新西兰大白兔CTX-Ⅰ和TRACP-5b水平比较（）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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3.3 各组新西兰大白兔血清中MMP-3水平比较 见表2。结果显示，与空白组比较，模型组的MMP-3 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比较，中药组与阳性对照组的MMP-3水平显著降低（P＜0.05）；中药组与阳性对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表2 各组新西兰大白兔MMP-3水平比较（）

表2 各组新西兰大白兔MMP-3水平比较（）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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4 讨 论

膝骨关节炎的病理改变主要是软骨损伤、软骨下骨和半月板的改变以及骨赘的形成，国内外大部分关于膝骨关节炎的研究都着眼于软骨的损伤和半月板的病变，然而近年来软骨下骨的病理改变引起了越来越多研究者的关注［9-10］。膝关节软骨下骨包括骨皮质和骨松质，两者紧密相连，不仅可以吸收关节应力、缓冲震荡，还具有保护和营养软骨组织的作用，软骨下骨和软骨相互影响共同构成一个功能复合单元［11］，在生理条件下，软骨下骨的重塑依赖于成骨细胞和破骨细胞相互协调作用［12］。若膝关节长期遭受异常应力反复作用，则会打破协调，出现软骨下骨重塑异常，降低软骨下骨吸收应力和保护软骨的作用。在骨关节炎软骨下骨病理改变初期，破骨细胞活性提高，骨吸收活跃，大量分泌钙-膦酸盐复合物，导致软骨退变，软骨下骨厚度降低，生物力学和结构的改变继发导致骨形成代偿性活跃。在异常的骨形成与吸收背景下，虽然表现为软骨下骨的骨量增加，但是单位骨密度总体是降低的；因此，有效调控软骨下骨代谢，使骨有充分时间矿化，才能完成骨组织的结构和功能修复过程［13］。

Ⅰ型胶原是骨基质中有机质的主要成分，约占90%以上，在骨组织的矿化和钙化中起到重要作用，其含量对骨的强韧度有一定的影响。MMP-3 可通过影响骨细胞外基质中的胶原和非胶原的代谢来调控骨的重塑，其通过与骨桥蛋白结合激活前体MMP-3，并形成复合物，参与到Ⅰ型胶原骨代谢的过程，影响骨的矿化，参与软骨下骨的骨代谢［13］。此外，有研究发现，软骨下骨在关节炎的中晚期分泌的血管内皮细胞生长因子明显增多，可促进新血管的生成。骨髓内的基质干细胞沿新生成的血管附着于软骨表面并分化为成骨细胞，分泌Ⅰ型胶原，导致钙磷沉积形成骨赘［14-15］。另外，骨小梁重塑过程中还会引起骨质硬化，增加了软骨承受的应力，加速了软骨的退变，在重塑过程中关节面的形态也随之发生改变，影响了关节面接触面积，同样也会加速软骨的磨损，导致膝骨关节炎的发生［16］。由于膝关节软骨无感觉神经分布，因而该区域的损伤并不会引起疼痛。有研究表明，膝关节软骨下骨分布着大量降钙素基因相关肽阳性感觉神经纤维，提示膝骨关节炎的疼痛主要来源于软骨下骨区域［17-18］。有学者在动物实验中发现，当软骨下骨成骨细胞和破骨细胞活跃时，会分泌致痛因子，导致小鼠疼痛增加［19］；在去卵巢的高骨转换小鼠模型基础上用碘乙酸钠注射膝关节腔进行膝骨关节炎造模，其高骨转化状态同样也引起了小鼠膝关节疼痛加剧［20］，这充分地说明了软骨下骨代谢的异常是膝骨关节炎产生疼痛的主要原因之一，通过调控骨代谢的异常可能是改善患者膝关节疼痛的重要途径。

目前市场上主要调控骨代谢异常的药物包括降钙素、双膦酸盐类、雌激素类等药物，但此类药物大多需长期坚持服用，极容易导致肝肾功能损害等不良反应的发生，而且价格较为昂贵。中医药治疗膝骨关节炎具有疗效显著、不良反应少、价格低等优点，越来越受到重视，是国内治疗膝骨关节炎的主要手段之一［21］。Zhu 等［22］研究表明，在关节炎早期关节软骨发生退变之前，破骨细胞介导的骨吸收就开始出现增强，导致骨量减少，出现软骨下骨结构的改变、生物力学以及生物化学信号异常，从而影响骨形成相关通路的异常，造成软骨下骨骨代谢异常、骨质增生、软骨退变。通过这一病理特点可为早期干预软骨下骨的异常吸收，防治膝骨关节炎提供依据。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是一种主要存在于破骨细胞中的蛋白分子，骨吸收时TRACP参与骨基质中固体钙磷矿化底物降解，TRACP-5b 是其中的一种分型，其主要来源于破骨细胞，特异性较高，是一种重要的骨吸收标志物［23］。Ⅰ型胶原为异质三联体蛋白，是骨组织合成与代谢的重要指标，当其分泌到细胞外后，在蛋白酶的作用下切除氨基端和羧基端肽成为胶原分子，再进一步组装成不溶性胶原纤维。在氨基端和羧基端末端，一个Ⅰ型胶原分子非螺旋末端肽部分与另一分子螺旋区域形成分子间交联。交联的形成保证胶原纤维有序排列及结构完整，构成纤维网状结构。胶原降解过程中，交联部位脱落，作为重要的骨转移或骨吸收指标，血清CTX-Ⅰ在骨代谢性疾病中具有重要的参考意义［24-25］。在本实验中，与空白组比较，模型组新西兰大白兔血清中TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平明显升高，提示模型组膝关节软骨下骨骨吸收增强，关节结构破坏，经加味独活寄生合剂治疗后，模型兔血清中TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平降低，表明加味独活寄生合剂能减少骨质吸收，对膝骨关节炎起到一定的治疗或预防作用。

基质金属蛋白酶-3（MMP-3）是基质金属蛋白酶中的一类，贯穿于膝骨关节炎发病的始终，它产生于滑膜细胞和成纤维细胞中，能主导细胞外的基质降解。当膝骨关节炎病变时，软骨MMP-3分泌增加，软骨细胞外基质中蛋白多糖、骨连接蛋白、弹性蛋白以及各种胶原蛋白发生降解，使软骨厚度变薄，同时MMP-3还能激活其他基质金属蛋白酶，如MMP-1、MMP-8等，从而发生退行性病变［26-28］。除了作为炎性标志物诱导膝骨关节炎的进展，在骨代谢的过程中MMP-3同样也发挥着作用，MMP-3可以与骨桥蛋白结合形成复合体，既能刺激成骨细胞促进骨形成，又能刺激破骨细胞，加快骨吸收，从而使骨转换率升高，影响骨组织局部微环境，改变骨基质；但是骨转化率异常升高容易导致骨组织结构发生变化，应力结构发生改变。通过抑制MMP-3 的表达，可以有效降低骨转化率，改善软骨下骨的骨组织结构。本研究发现，模型组新西兰大白兔血清中MMP-3 含量较空白组明显升高，提示膝关节内可能发生剧烈的炎症反应，骨组织局部微环境遭到破坏。经加味独活寄生合剂干预后，血清中MMP-3的含量明显降低，提示加味独活寄生合剂治疗膝骨关节炎可能是通过抑制炎症反应，改善膝关节软骨下骨骨代谢来实现的。

本实验通过膝关节腔注射木瓜蛋白酶的方法建立兔膝骨关节炎模型，并运用加味独活寄生合剂进行干预，研究其血清中Ⅰ型胶原C 端肽、MMP-3 以及抗酒石酸酸性磷酸酶5b含量的变化，在一定程度上揭示了加味独活寄生合剂治疗膝骨关节炎对机体骨代谢以及炎症水平的影响，取得了部分研究成果。但在实验的过程中仍存在一定的局限性，如在实验过程中只注重了实验开始和结尾的对比，对于实验过程中相关指标的变化情况未予以追踪，后续将进行进一步的研究。