补气通窍方对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜病理损伤和IgE的影响

陈俊峰，桂雄斌，王明刚

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由特异性抗体IgE 介导，多种免疫活性细胞和细胞因子共同参与的一种鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。AR 的临床表现以喷嚏、流涕、鼻痒和鼻塞为主要症状，是临床常见病、多发病［1］。近年来，AR 发病率不断上升，据统计全球性的发病人数已超6亿［2］。当前临床多采用糖皮质激素类、H2抗组胺类药物作为控制AR 的一线药物［3］，但效果不甚理想。中医治疗变应性鼻炎重视扶正固本，调节和增强免疫功能，具有明显的优势。课题组前期实验研究发现，补气通窍方能有效缓解变应性鼻炎患者的鼻炎症状，临床疗效满意［4］。本研究通过构建AR 大鼠模型，初步探讨补气通窍方对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜病理损伤和免疫球蛋白E（IgE）水平的影响，为补气通窍方的临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级健康Wistar 大鼠50 只，6～8 周龄，体质量250～300 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（湘）2019-0014。

1.2 试药与试剂 补气通窍方（中药组成：黄芪20 g、党参12 g、甘草12 g、苍耳子20 g、辛夷花10 g、细辛3 g、荆芥15 g、桔梗10 g、升麻10 g、柴胡10 g），由广西中医药大学第一附属医院中药房提供，使用江阴天江药业有限公司的中药配方颗粒剂调制。卵清蛋白（美国Sigma Aldrich 公司，批号：MN-4236596）；氢氧化铝（研域化学试剂有限公司，批号：SX-6354158）；大鼠卵清蛋白特异性免疫球蛋白E（OVA sIgE）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0517c）；苏木素（美国Sigma 公司，货号H9627）；HE 染色试剂盒（中国碧云天生物科技有限公司，批号：TY-741536）。

1.3 仪器 C2500-R-230V 型微型高速离心机（美国莱伯特公司）；ICV-450 型电热恒温培养箱（日本ASONE 公司）；Multiskan MK3 型全自动酶标仪（美国Thermo scientific 公司）；BX53 型生物显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2 方 法

2.1 动物分组、造模与给药 采用随机数字表法将50只Wistar大鼠随机分为5组：空白组，模型组和补气通窍方低、中、高剂量组，每组10 只。除空白组外，模型组和补气通窍方低、中、高剂量组参照文献［5］方法复制AR 大鼠模型：大鼠腹腔注射卵白蛋白抗原佐剂混悬液OVA［每毫升生理盐水中含卵白蛋白0.3 mg 及Al（OH）330 mg］致敏，隔日1 次，共14 d；自第15 d 起，大鼠两侧鼻孔各滴入10%卵清蛋白溶液（生理盐水配制）50 μl 行鼻腔激发，每天1 次，共7 d。每次滴鼻结束后观察大鼠30 min 内抓鼻、喷嚏次数及流涕情况并记录，动物行为学积分评分标准见表1。以叠加法记录总分，行为学总分≥5 分为建模成功［6］。空白组滴鼻予以等量生理盐水。在OVA 滴鼻行鼻腔激发的同时给予药物干预，补气通窍方低、中、高剂量组剂量分别为14.38 g/kg、28.76 g/kg、57.55 g/kg［4］，连续灌胃给药7 d，灌胃容量为4 ml/d；空白组和模型组大鼠给予等容量纯净水灌胃。

表1 动物行为学积分评分标准

2.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测外周血IgE水平 末次灌胃给药24 h 后将大鼠以10%水合氯醛3 ml/kg 麻醉，用无菌手术剪剪开大鼠腹部，剥离腹主动脉采血10 ml，并快速分离血清，将血清在-80 ℃下保存，采用ELISA 法于波长450 nm 的酶标仪上检测。根据大鼠卵清蛋白特异性免疫球蛋白E（VOA sIgE）酶联免疫吸附测定试剂盒内附的标准品血清测定的OD值结果，得出标准曲线，再通过测定各大鼠血清IgE 的OD值，根据标准曲线算出各大鼠的血清IgE的浓度。

2.3 病理形态学检测 血液采集后沿大鼠双眼眶下剪下鼻骨，钳出鼻中隔，剥离鼻中隔两侧鼻黏膜及分离出鼻腔外侧壁鼻黏膜，用40 g/L 多聚甲醛浸润固定12 h以上，冲水24 h，分别以50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡后，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，常规苏木精-伊红染色病理学检查。每张切片在光镜400 倍下取6～8 个视野，观察鼻黏膜腺体有无萎缩，比较各组鼻组织纤毛状态，腺体有无增生，黏膜厚度及上皮细胞、杯状细胞数量。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，两样本均数间的比较采用t检验，多个样本间的比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 补气通窍方对AR大鼠行为学的影响 造模大鼠在第1 次给予OVA 滴鼻行鼻腔激发后，30 min 内就出现喷嚏、抓鼻和流涕的症状，大鼠的行为学评分叠加计分＞5 分，提示造模成功。随着滴鼻次数的增加，模型组大鼠症状逐渐加剧，出现了典型的变应性鼻炎症状，行为学积分明显高于空白组（P＜0.01）。给予不同剂量的补气通窍方干预后，大鼠的行为学症状明显得到缓解，行为学积分开始下降，其中补气通窍方中、高剂量组从第2 d～第7 d 的行为学评分均显著低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）；表明补气通窍方能显著改善AR大鼠的临床症状，结果见图1、表2。

图1 各组大鼠行为学评分变化

表2 各组大鼠行为学评分变化比较（分，）

表2 各组大鼠行为学评分变化比较（分，）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组同时间点比较，②P＜0.01，③P＜0.05

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3.2 各组大鼠血清IgE 水平比较 根据大鼠卵清蛋白特异性免疫球蛋白E（VOA sIgE）酶联免疫吸附测定试剂盒内附的标准品得出标准曲线（见图2），再通过测定各大鼠血清IgE 的OD 值，算出各大鼠的血清IgE 的浓度。与空白组比较，模型组血清IgE 水平在AR 大鼠血清中浓度明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，补气通窍方低、中、高剂量组血清IgE水平有所下降，差异有统计学意义（P＜0.01），提示补气通窍方可降低AR 大鼠血清IgE 水平，结果见表3。

图2 VOA sIgE对照品标准曲线

表3 各组大鼠血清IgE水平比较（）

表3 各组大鼠血清IgE水平比较（）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

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3.3 各组大鼠鼻黏膜病理损伤情况 空白组：鼻黏膜可见假复层纤毛柱状上皮，纤毛完整，固有层未见水肿、充血等改变，无腺体增生。模型组：鼻黏膜纤毛有排列杂乱、脱落及倒伏现象，出现较多淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，黏膜下腺体数量明显增加，小血管可见增生扩张。补气通窍方低剂量组：鼻黏膜纤毛柱状上皮可见部分纤毛恢复，上皮内见炎性细胞浸润，固有层水肿、充血，腺体增生。补气通窍方中剂量组：鼻黏膜纤毛柱状上皮部分纤毛恢复，上皮内浸润着少量嗜酸细胞等炎性细胞，固有层无明显水肿，可见轻度充血，并可见少许嗜酸细胞、淋巴细胞浸润，腺体轻度增生。补气通窍方高剂量组：病理形态恢复，与空白组比较相近，固有层偶见少量炎性细胞，腺体轻度增生。结果见图4。

图4 各组大鼠鼻黏膜病理改变（×400）

4 讨 论

AR 是IgE 介导的Ⅰ型变态反应，发生在鼻黏膜，主要以促炎因子释放、鼻腔黏液过度分泌为主要病理特征［7］。IgE 是参与体液免疫的重要免疫球蛋白，吸入性变应原可诱导特异性IgE 产生，IgE 具有亲细胞性与特异性，可以与鼻黏膜中的肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合，形成致敏性细胞，当机体再次接触特异性抗原时，致敏细胞表面的IgE 与特异性抗原“交联”“搭桥”，活化肥大细胞和嗜碱性粒细胞，产生组胺、白三烯等炎性介质，使黏膜充血、水肿、分泌物增多，从而导致AR的发生发展［8］。降低血清IgE的水平，可减少变态反应的发生，抑制变应性鼻炎的产生。

变应性鼻炎属中医“鼻窒”范畴，根据病邪的性质，分为内因和外因，内因多为肺、脾功能失调，外因为风寒疫气入侵。肺气虚，卫表不固，风寒疫气趁虚而入，侵犯鼻窍，正邪相搏，肺失宣降，致津液内停，壅塞鼻窍，致鼻塞流涕；脾气虚，母病累及其子，亦可致肺气虚，脾失健运，聚湿成痰，肺失其宣降而痰嗽喘咳；外因风寒疫气及内因肺脾气虚，均可导致鼻窒的产生。中医对“鼻窒”的认识可追溯至先秦时期古籍《礼记·月令》，其中记载“季秋行夏令，则其国大水，冬藏殃败，民多鼽嚏”；汉代《素问·脉解》中提到“所谓客脉者，则头痛、鼻鼽、腹肿者”。补气通窍方由黄芪、党参、甘草、苍耳子、辛夷花、细辛、荆芥、桔梗、升麻、柴胡组成，方中黄芪补益肺脾之气；党参助君药补益中气；甘草能健肺脾之气同时调和诸药；苍耳子、辛夷花是治疗鼻炎的要药，可辛散风邪、芳香通窍；细辛、荆芥散风寒通鼻窍；桔梗载药上行，散结出涕；柴胡、升麻分别是少阳、阳明之药，分别引人体之气自左、右上升，在方中起发表解肌并升举中阳之效。全方宣中有补，补益肺脾气以助祛风透达通鼻窍，具有益气固卫、健脾化痰、祛风透达通窍之功效。

本实验复制大鼠AR 模型，通过记录大鼠动物行为学的积分，检测血清IgE 水平，并采用常规苏木精-伊红染色病理学检查鼻中隔和鼻腔外侧壁呼吸区黏膜组织的病理形态，探讨补气通窍方治疗过敏性鼻炎的可能机制。研究结果表明，变应性鼻炎大鼠经补气通窍方治疗后，大鼠的喷嚏、抓鼻、流涕等行为学症状明显得到缓解，其中中、高剂量组第2 d～第7 d 的行为学评分均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），表明补气通窍方对AR有明显的改善作用。补气通窍方各剂量均能显著降低变应性鼻炎大鼠血清IgE水平（P＜0.01），并能明显改善变应性鼻炎大鼠鼻组织病理损伤。

综上所述，补气通窍方能显著降低血清IgE 水平，改善鼻黏膜组织的病理形态，缓解变应性鼻炎临床症状，抑制变应性鼻炎的发生，进一步明确了补气通窍方治疗变应性鼻炎的作用机制。