百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌感染蛋雏鸡生长性能、抗氧化能力和肠道形态的影响

2023-11-14周秉桦苏奕婧杜芸廷杨仕群

饲料工业 2023年21期

■ 周秉桦阳刚苏奕婧王雨杜芸廷舒刚杨仕群*

(1.宜宾职业技术学院，四川宜宾 644000；2.四川农业大学，四川成都 611130)

鸡白痢沙门氏菌（S.pullorum）可依靠特异性菌毛在黏膜表面附着并进入肠上皮细胞[1]，引起肠道溃疡病变和腹泻，从而导致雏鸡白痢病。该传染病主要感染2～3 周龄雏鸡，且疫情风险、病死率均较高[2]，给鸡养殖业造成了巨大的经济损失。传统防治鸡白痢的方法为使用鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗或使用抗生素。但灭活疫苗不能提供交叉免疫保护，面对复杂的沙门氏菌血清型，提供的保护范围有限。此外，长期滥用抗生素，导致早期对鸡白痢有效的氨苄西林、庆大霉素等药物出现敏感性下降或耐药等状况。因此，寻找天然、安全、高效的替抗产品，对于防治雏鸡白痢、减少禽业经济损失具有重要意义。

中草药添加剂具有抗氧化、抗菌等广泛的生物活性，可促进动物生长发育[3]、调控动物肠道菌群的结构组成[4]、提高家禽免疫功能[5]，保障家禽健康。大量研究表明，中草药添加剂在饲用抗生素替代方面具有很好的应用前景，代如意等[6]用虎杖、诃子和紫花地丁等制备中药添加剂组方，发现该组方对雏鸡白痢治愈率达62.5%～72.0%，保护率达75.0%～83.3%，接近庆大霉素。徐亚慧[7]研究发现，马齿苋发酵物可以通过降低肉鸡盲肠中的沙门氏菌数量，提高乳酸菌和双歧杆菌的数量减少鸡白痢沙门氏菌引起的肠道损伤，而氟苯尼考在降低沙门氏菌数量的同时也降低了益生菌的数量。

姜黄（Curcuma longaL.），是姜科植物的干燥根茎，具有温经散寒、滋补脾胃等功效。姜黄素（Curcumin）是中药黄姜的主要活性成分之一。姜黄素具有多种药理作用，如抗氧化[8]、抗炎[9]、保护肝肾[10]、调节肠道健康[11]、增强免疫[12]等，且无明显毒性作用[13]。百里香（Thymus mongolicusRonn），是唇形科百里香属植物，具有祛风解表、行气止痛等功效。百里香酚（Thymol）又名百里酚、麝香草酚，是从中药百里香的挥发油中提取的单体物质。据报道，百里香酚具有抗氧化[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、免疫调节[17]等广泛的作用。研究表明，百里香酚可以有效改善鸡的免疫能力，保护肝脏和肠道[18-19]。

百里香酚是已知植物精油成分中最有效的成分之一，具有较强的抗沙门氏菌活性[20]。而姜黄素具有较好的抗炎作用[21]，能与其他抗菌药发挥协同作用，降低耐药风险，因而二者复配具有一定的替抗潜能。但目前姜黄素在动物生产中的报道不多，主要集中在其对生长性能、免疫性能和肉品质的影响作用。此外，对百里香酚的研究大多将其同香芹酚、肉桂醛等作用类似的天然香料提取物复配，观察协同抗沙门氏菌作用，而对百里香酚联合姜黄素作为饲料添加剂的相关研究较少，且近年来的研究集中于其对肉鸡、猪、奶牛等的影响，而对蛋鸡尤其是蛋雏鸡的临床应用效果研究较少。本研究选取姜黄素与百里香酚的组合为研究对象，考察二者联合应用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡的生长性能、抗氧化能力、肠道形态结构的影响，为中草药防治雏鸡白痢提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌液及材料

1.1.1 鸡白痢沙门氏菌菌液复苏

鸡白痢沙门氏菌ATCC13036 标准株由四川农业大学动物医学院药学系保存，室温速融后用移液枪将菌种轻吹混匀，取200 μL菌液加入装有2 mL LB肉汤培养基的离心管中，置入36 ℃恒温摇床内过夜。待肉汤眼观浑浊后，接种至涂有SS 琼脂的平皿，30～36 ℃条件下培养18～24 h。挑取中心部位呈黑色的单个菌落接种至200 mL LB 培养基中，37 ℃恒温培养8 h 后，用灭菌生理盐水将菌液稀释至1.0×106CFU/g[22]。

1.1.2 试验药品

百里香酚-姜黄素混合物∶百里香酚和姜黄素按质量比2∶1 混合而成（按照150 mg/kg 百里香酚和75 mg/kg 姜黄素添加到基础日粮中）。百里香酚（纯度≥98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司）；姜黄素（纯度≥98%，购自成都格利普生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器

TGL-16G高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、ESJ-S 电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）、BIO-RAD 酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）、DH-360 恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.3 试验动物及处理

将120 只1 日龄健康蛋雏鸡随机分为4 个处理组，分别是空白对照组（CON）、百里香酚-姜黄素组（CT）、攻毒组（PD）、攻毒+百里香酚-姜黄素组（PD+CT）。每个处理3 个重复，每个重复10 只鸡。CON 组和PD 组仅饲喂基础日粮，CT 组和PD+CT 组于7 日龄开始在基础日粮中添加百里香酚-姜黄素复合物225 mg/kg。基础饲粮参照《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）配制，其组成及营养水平见表1。饲喂7 d 后，PD组和PD+CT组每只鸡腹腔注射0.5 mL前述鸡白痢沙门氏菌菌液进行攻毒，其余组用等量生理盐水代替，继续观察7 d。饲养期间，采用加热灯24 h人工光照，控制温度在15～25 ℃，试验鸡只自由采食和饮水，消毒和免疫按常规进行。

表1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.4 样品采集

试验结束后，禁食12 h，于每个重复组中随机抽取2只鸡，称重，翅静脉采血，2 500 r/min离心10 min，制备血清；采血后麻醉处死，取肝脏和空肠组织于-20 ℃冷冻保存，用于组织抗氧化指标测定；另取一部分空肠组织于4%多聚甲醛固定液中保存，用于病理组织学观察。

1.5 检测指标

1.5.1 生长性能指标

每周周一、周日下午固定时间空腹称重鸡只，计算平均体重、平均日增重；试验期间每日对所给日粮及清扫料槽后的余料称重，记录耗料量，计算试验期平均日采食量、料重比；攻毒后每天记录死亡鸡只数，计算存活率。

1.5.2 脏器指数

试验结束后，各组鸡称重并处死，剖取肝脏、十二指肠、空肠和回肠，称重，计算相应脏器指数。

脏器指数（g/kg）=器官重量(g)/宰前活重(kg)

1.5.3 血清抗氧化指标

取血清样品，测定雏鸡28 日龄血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA），严格按照试剂盒说明书进行（试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.5.4 组织抗氧化指标

取肝脏、空肠组织样品，按照试剂盒说明书测定组织中T-SOD、GSH、T-AOC活性及MDA含量。

1.5.5 空肠组织形态

取出固定好的空肠样本，分装于长孔组织包埋盒中，按脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烘片、染色、封片的流程制备切片，光学显微镜下观察组织病理变化情况并用Image-J 图像处理系统测定每张照片中10根完整且最长的肠绒毛的绒毛高度及隐窝深度，计算绒隐比。

1.6 数据统计与分析

试验数据用SPSS 20.0 软件进行统计，采用单因子方差分析进行差异显著性检验，用最小显著差数法（LSD）进行多重比较，结果均以“平均值±标准差”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡生长性能的影响

由表2 可知，与CON 组相比，CT 组的平均日增重有提高趋势（P>0.05），PD 组的平均日增重、平均日采食量显著降低，料重比显著升高（P<0.05）。与PD 组相比，PD+CT 组的平均日增重显著升高，料重比显著降低（P<0.05）。

表2 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡生长性能的影响

2.2 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡脏器指数的影响

由表3 可知，与CON 组相比，PD 组的肝脏指数显著升高（P<0.05），十二指肠和空肠指数显著降低（P<0.05）；与PD 组相比，PD+CT 组的空肠指数显著升高（P<0.05）。

表3 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡脏器指数的影响（g/kg）

2.3 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡抗氧化指标的影响

由表4 可知，与CON 组相比，CT 组的血清GSH 水平显著提高（P<0.05），MDA 含量显著降低（P<0.05），PD 组的血清GSH 水平显著降低（P<0.05），MDA 含量显著升高（P<0.05）。与PD 组相比，PD+CT 组血清的各项抗氧化指标无显著变化（P>0.05），但GSH 有升高的趋势（P>0.05），MDA有降低的趋势（P>0.05）。

表4 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡血清抗氧化指标的影响

由表5可知，与CON组相比，CT组的肝脏MDA含量显著降低（P<0.05）。PD 组的肝脏GSH 水平显著降低，MDA 含量显著升高（P<0.05）。与PD 组相比，PD+CT 组的肝脏GSH 水平显著升高（P<0.05），MDA 含量显著降低（P<0.05）。

表5 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡肝脏抗氧化指标的影响

由表6 可知，与CON 组相比，CT 组的空肠T-AOC水平显著升高，PD组的空肠T-AOC、T-SOD水平显著降低，MDA 水平显著升高（P<0.05）。与PD 组相比，PD+CT 组的空肠T-SOD 水平显著升高（P<0.05），MDA水平显著降低（P<0.05）。

表6 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡空肠抗氧化指标的影响

2.4 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡空肠形态的影响

由图1 可知，与CON 组相比，CT 组的隐窝变浅、结构更为清晰，肠绒毛显著变长，肠壁肌层无明显病变，PD 组的空肠组织结构破碎，肠绒毛大部分断裂或明显变短，肠绒毛顶部肠上皮细胞肿胀脱落、固有层溶解，浆膜和环状肌肌层细胞粘连坏死，结构模糊，隐窝萎缩或融合消失。与CON 组相比，PD+CT 组的隐窝更深且变形，环状肌肌层间有炎性反应带，但相比PD组仍具备相对较为完整的结构。

图1 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡空肠绒毛形态的影响

由表7 可知，与CON 组相比，CT 组的空肠绒毛高度、绒隐比有升高趋势、隐窝深度有降低趋势（P>0.05），PD 组的空肠绒毛高度、绒隐比显著降低，隐窝深度显著升高（P<0.05）。与PD 组相比，PD+CT 组的空肠绒毛高度、绒隐比显著升高，隐窝深度显著降低（P<0.05）。

表7 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡空肠形态结构的影响

3 讨论

3.1 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡生长性能的影响

生长性能是衡量家禽饲养水平和经济效益的重要参考指标。王志[23]于常温环境下在成年罗曼蛋鸡日粮中添加姜黄素，发现与对照组相比，日粮中添加姜黄素，有提高料蛋比、平均日采食量的作用。本试验在蛋雏鸡日粮中添加姜黄素和百里香酚，有降低蛋雏鸡平均日采食量的趋势，可能是由于28 日龄以下雏鸡的肠道功能尚不完善、正常菌群未完成定植[24]，因此对药物的适应度低，以及添加药物饲料的适口性较差。本试验还发现攻毒后蛋雏鸡平均日增重显著降低，料重比显著升高，而添加百里香酚-姜黄素缓解了这一趋势，表现为PD+CT 组的平均日增重和料重比与CON 组差异不显著。这与张文静[25]的研究结果一致。试验表明，日粮中同时添加百里香酚和姜黄素对蛋雏鸡无不利影响，并能够显著降低鸡白痢沙门氏菌对生长性能的损害作用。

3.2 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡脏器指数的影响

器官指数是反映雏鸡发育的重要指标，其改变可以在一定程度上反映雏鸡的生理或病理状态。王子文[26]在肉仔鸡日粮中添加百里香酚和肉桂醛的复合物，显著提高了肉仔鸡的空肠相对重量，这与本试验结果一致，且与前述百里香酚-姜黄素降低蛋雏鸡料重比的结果一致，表明复合植物提取物对雏鸡肠道发育具有促进作用，从而提高消化吸收能力。本试验还发现，在鸡白痢沙门氏菌攻毒的蛋雏鸡日粮中添加百里香酚-姜黄素，显著提高了空肠指数，提示该复合物可能对肠道具有一定保护作用。

3.3 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡抗氧化功能的影响

T-AOC 是指各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平，SOD、GSH 是T-AOC 体系中酶促反应系统的重要组成部分，其活性是考察机体抗氧化能力的重要指标[27]。畜禽在遭受应激、病原入侵等情况下，自由基代谢发生紊乱，超过抗氧化酶清除能力，造成过量活性氧（ROS）堆积，从而引发脂质过氧化反应并形成MDA。因此MDA 含量的高低是衡量机体遭受氧化胁迫程度的常用指标之一。研究表明，百里香酚和姜黄素在雏鸡体内均表现出较好的抗氧化活性[28-29]，但姜黄素的生物利用度较差[30]。李光辉等[31]研究发现，饲料添加100～300 mg/kg姜黄素均可提高罗曼蛋鸡各器官和血液中GSH、SOD和CAT 水平。本试验结果显示，在饲料中添加百里香酚（150 mg/kg）和姜黄素（75 mg/kg），能提高蛋雏鸡肝脏和血清GSH 和SOD 活性，并降低肝脏、血清中脂质过氧化物MDA 的含量（P<0.05），这与李光辉等[31]的研究结果相似，表明百里香酚并未降低姜黄素的生物活性，二者联用无明显的颉颃效应和毒性反应。

核因子-红细胞2 相关因子2（Nrf2）是调控胞内氧化应激的重要转录因子[32]。细胞因氧化损伤产生的活性氧（ROS）一旦超过安全值，就会激活Nrf2 内源性抗氧化通路，迅速消灭过多的ROS，恢复机体氧化和抗氧化体系的平衡[33]。许多研究表明，姜黄素是Nrf2 途径的激动剂[34]。百里香酚的苯酚羟基基团可捕获羟自由基。本试验中，与PD 组相比，PD+CT组的肝脏GSH 水平和空肠T-SOD 水平显著升高（P<0.05），肝脏和空肠中MDA 含量显著降低（P<0.05），这与尹莉丽等[35]的研究结果基本一致，提示姜黄素和百里香酚通过直接清除自由基和上调Nrf2 信号通路相关蛋白表达，改善相关抗氧化酶活性和总抗氧化水平，进而有效缓解鸡白痢沙门氏菌引起的肝脏、肠道细胞氧化应激。本试验中添加百里香酚-姜黄素提高了健康蛋雏鸡和鸡白痢攻毒蛋雏鸡的各抗氧化指标，这与前述PD+CT 组空肠脏器指数显著提高一致，可以进一步说明二者联用可以通过捕捉自由基、修复氧化损伤等多种方式提高蛋雏鸡机体抗氧化能力，保护肝脏和肠道，改善鸡白痢沙门氏菌对蛋雏鸡机体的不利影响。

3.4 百里香酚与姜黄素联用对鸡白痢沙门氏菌攻毒蛋雏鸡空肠形态的影响

小肠的绒毛高度和隐窝深度及绒隐比是反映肠道通透性、吸收性和肠道黏膜功能是否完善的重要指标。肠细胞间的紧密连接（TJs）在肠上皮屏障的形成中起主导作用，TJs 受损可导致细菌、内毒素通过TJs 进入体循环，引起家禽肠道疾病的发生。闭锁蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudin）和闭合小带蛋白（ZO-1）是组成肠上皮细胞间紧密连接的重要分子基础[36]。Magesh 等[37]研究发现，沙门氏菌感染可导致空肠中Occludin和ZO-1基因表达下调。研究表明，姜黄素可通过上调ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达量改善脓毒症大鼠肠上皮屏障的完整性[38]，而百里香酚可以通过提高盲肠Occludin、Claudin-1、ZO-1的mRNA 表达水平降低沙门氏菌引起的肉鸡盲肠通透性增加[39]。本试验发现，百里香酚联合姜黄素提高了鸡白痢沙门氏菌感染蛋雏鸡的空肠绒毛高度，且与CON 组无显著差异(P>0.05）。与本试验结果不同，Abudabos 等[40]研究表明，饲粮添加1.0 g/kg牛至精油显著提高了肠道沙门氏菌感染肉鸡的回肠绒毛高度，但显著低于健康肉鸡的回肠绒毛高度(P<0.05）。这可能是因为百里香酚主要在肠的上半部分被吸收[41]，对空肠绒毛隐窝比的改善最为显著，而对回肠绒隐比的提高作用较弱。此外，本试验中CT+PD 组的空肠绒毛高度与CON 组无显著差异，还可能与其发挥协同作用，改善沙门氏菌引起的紧密连接蛋白表达水平降低有关，但具体机制仍需进一步研究。本试验在鸡白痢攻毒蛋雏鸡的饲料中添加百里香酚-姜黄素，显著改善了鸡白痢沙门氏菌引起的蛋雏鸡空肠肠绒毛萎缩和隐窝加深，与上述空肠T-SOD 和MDA 活性结果一致，提示百里香酚联合姜黄素可以通过减少ROS 诱导的肠道氧化应激和组织损伤、恢复机体SOD 抗氧化酶系活力，从而保护肠上皮细胞免受自由基威胁，促进肠黏膜损伤修复，维护空肠黏膜屏障完整性。