QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中阿奇霉素含量

■ 朱万燕 徐文远* 张鸿伟 伦才智 鲍春晓 徐 豪 徐久飞 王正国

（1.临沂海关综合技术服务中心，山东临沂 276034；2.青岛海关技术中心，山东青岛 266000）

随着人民生活水平的提高，动物源性产品的数量已不再是人民首要关注的问题，其质量安全成为人民关注的重点。饲料质量安全是影响动物源性产品质量安全的重要因素之一。阿奇霉素作为新一代大环内酯类广谱抗生素，对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及厌氧菌都具有较好的抗菌效果，受到养殖业的青睐，被越来越多地作为饲料添加剂应用在动物身上。养殖业不合理使用阿奇霉素，一方面可诱发耐药菌株，通过食物链迁移到人体，产生耐药性[1]；另一方面，人食用含有阿奇霉素残留的动物食品后，会在体内蓄积，损害胃肠、肝胆、血液、神经系统。有关调查表明，因阿奇霉素的滥用已产生耐药菌株。因此，建立饲料中阿奇霉素的检测方法对于监控饲料质量安全、进而保证食品安全具有重要意义。

兽药残留检测的方法主要有酶联免疫法[2]、气相色谱质谱法[3]、高效液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5-7]。液相色谱-质谱联用法因具有定性准确、灵敏度高等优点，成为目前积极推广应用的检测方法。目前，报道较多的是关于阿奇霉素在动物性食品中的残留检测研究[8-10]，饲料中阿奇霉素的残留检测鲜有报道[11]。QuEChERS 技术因具有简单、快速、环保、成本低等特点，已越来越多地被应用在兽药残留前处理中[12-14]。本试验以饲料为检测基质，以QuEChERS 方法进行前处理，建立了饲料中阿奇霉素的超高效液相色谱串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）检测方法，方法准确、简单、快速、省时省力，可以为饲料中阿奇霉素的安全监督提供技术支持，从而有效控制动物源性产品污染。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6470 型超高效液相色谱串联质谱仪，购自美国Agilent 公司；CR22GⅢ高速冷冻离心机，购自日本HITACHI 公司；ULTRA-TURRAX T25 型均质器，购自德国IKA 公司；GENIUS 3 基本型涡旋混匀器，购自德国IKA 公司；HS260 型多用调速振荡器，购自德国IKA 公司；Caliper TurboVap LV 氮吹仪，购自美国公司。

阿奇霉素标准品（CAS 号83905-01-5，纯度94.4%），BePure 标准物质；乙腈（色谱纯），购自美国MREDA 公司；甲醇（色谱纯），购自美国LabServ 公司；甲酸（色谱纯），购自天津市光复精细化工研究所；氯化钠（分析纯），购自天津博迪化工股份有限公司；中性氧化铝、十八烷基硅胶键合相（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、阴离子交换混合机理的水可浸润型聚合物（PAX）、石墨化炭黑（GCB）、氨丙基硅胶键合相、阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物（PCX），均购自天津Bonna-Agela 公司；试验用水为美国Millipore纯水系统制得的超纯水。

1.2 标准溶液配制

标准储备液的配制：准确称取经纯度折算后的阿奇霉素标准物质50 mg，置于50 mL 烧杯中，用甲醇溶解并定量转移至50 mL 容量瓶中，既得浓度为1 000 μg/mL的标准储备溶液。

标准中间液的配制：准确量取适量体积的阿奇霉素标准储备溶液，用甲醇稀释成50 μg/mL 的标准中间液。

1.3 样品前处理

提取：称取2.0 g 样品，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中，加入8 mL 水，涡旋1 min，静置30 min，将样品充分浸润分散，再加入3 g 氯化钠和8 mL 乙腈，振荡提取30 min，10 000 r/min 离心5 min，取6 mL 上清液待净化。

净化：将6 mL 上清液加入含有200 mg 乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）和100 mg 氨基吸附剂的15 mL 离心管中，涡旋1 min，10 000 r/min 离心5 min，再取5 mL 上清液于另一离心管中，氮吹至干，用1 mL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（体积比25∶75），复溶，过0.22 μm滤膜，上UPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器工作条件

超高效液相色谱条件：Eclipse Plus C18 色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相A 为0.1%甲酸水溶液（内含5 mmol/L 乙酸铵），B 为乙腈，梯度洗脱程序：0～2.5 min，10%～95% B；2.5～3.5 min，95% B；3.50～3.51 min，10%～95% B；3.51～8.00 min，10% B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：AJS 电喷雾离子源，正离子模式/多反应离子监测模式（MRM）；干燥气温度（Gas Temp）：300 ℃；干燥气流速（Gas Flow）：10 L/min；雾化气压力（Nebulizer）：138 kPa；鞘气温度（Sheath Gas Temp）：300 ℃；鞘气流速（Sheath Gas Flow）：12 L/min；毛细管电压（Capillary）：2 500 V；喷嘴电压（nozzle voltage）：0 V；Delta EMV（+）：400 V；阿奇霉素的母离子、子离子、保留时间、毛细管出口电压、碰撞能等参数见表1。

表1 阿奇霉素的质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

查阅相关文献，阿奇霉素多采用正离子模式监测，试验以1.0 μg/mL阿奇霉素标准溶液为研究对象，在不接色谱柱的情况下直接进质谱仪优化参数。具体在正离子全扫描模式下，确定目标化合物的母离子，同时优化毛细管出口电压，结果表明，阿奇霉素的质谱响应不是很高，只优化毛细管电压达不到理想效果，本试验在厂家推荐的起始离子源参数基础上，对离子源参数进行了进一步优化。试验发现，喷嘴电压由500 V降到0 V即去掉喷嘴电压后，目标化合物的响应提高了一倍；目标化合物的响应随着雾化器压力的升高反而降低，雾化器压力由241 kPa调至138 kPa时，目标化合物响应提高了50%；此外，在不影响化合物响应的基础上，为了尽量延长鞘气加热组件的使用寿命，将鞘气温度由400 ℃降至300 ℃。阿奇霉素的质谱扫描图见图1和图2。

图1 阿奇霉素的母离子扫描图

图2 阿奇霉素的子离子扫描图

2.2 色谱条件的选择

比较了Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Waters cortees UPLC C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），XBridge peptide BEH C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），HT C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）四种色谱柱，阿奇霉素在Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色谱柱上的峰型、响应最好，且可实现阿奇霉素与样品基质的基线分离。

经参考文献，试验比较了乙腈-0.1% 甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.4%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）四种流动相体系，结果显示：随着甲酸溶液浓度的增加，阿奇霉素的响应没有明显变化；当甲酸溶液中加入5 mmol/L的乙酸铵时，阿奇霉素的响应明显提高，且峰型有所改善，最终选择乙腈-0.1%甲酸溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）作为本研究的流动相。阿奇霉素的MRM色谱图见图3。

图3 阿奇霉素（5 μg/L）的MRM谱图

2.3 提取溶剂的优化

试验发现，当直接用乙腈提取配合饲料中的阿奇霉素时，回收率仅为30%左右，且用空白样品基质提取溶液配制标准溶液时基质效应严重；而当先加入水，之后再用乙腈提取时，回收率明显提高，达到80%以上。这可能是由于所用的饲料是干制样品，加入水后一方面可以使样品充分分散，有利于阿奇霉素的提取，另一方面样品中的部分极性干扰物质被提取到水中析出，降低了阿奇霉素的基质效应。试验进一步对水和乙腈的用量进行了优化，比较了4 mL水+4 mL乙腈、4 mL 水+6 mL 乙腈、4 mL 水+8 mL 乙腈、4 mL水+10 mL 乙腈、6 mL 水+6 mL 乙腈、6 mL 水+8 mL 乙腈、6 mL 水+10 mL 乙腈、8 mL 水+8 mL 乙腈、8 mL水+10 mL 乙腈、10 mL 水+10 mL 乙腈对阿奇霉素提取效率的影响，结果见图4。从图中可以看出，当水和乙腈的用量达到8 mL 时，阿奇霉素的回收率在80%以上，之后随着水和乙腈用量的增加，回收率没有明显变化，综合考虑回收率及成本、环保等因素，最终选择8 mL水+8 mL乙腈为本试验的提取溶剂。

图4 提取溶剂不同体积对回收率的影响

2.4 净化条件的优化

净化条件关系到整个试验的效果，在不影响回收率的情况下尽量去除提取液中的杂质是试验的目标，试验过程中分三个步骤对净化条件进行了优化：①吸附剂种类的初筛；②吸附剂去除杂质效果的比较；③吸附剂用量的优化。

吸附剂种类的初筛。首先考察了各种吸附剂对目标化合物的吸附性，具体方法如下：在浓度为20 μg/L的标准溶液中，分别加入中性氧化铝、C18、PSA、PAX、GCB、NH2、PCX，经充分振荡并离心后，取上清液过滤膜上机测定，比较标准溶液浓度前后有无变化。结果显示，经C18、PAX、GCB、PCX 吸附后，标准溶液浓度明显降低，表明这四种吸附剂对阿奇霉素有很强的吸附作用；而经中性氧化铝、氨基、PSA 吸附后，标准溶液浓度基本没有变化，表明这三种吸附剂对阿奇霉素的吸附作用小。因此，初步选定中性氧化铝、氨基、PSA对提取液进行净化。

吸附剂去除杂质效果的比较。试验比较了中性氧化铝、氨基、PSA 及两两组合对提取液的净化效果及对阿奇霉素回收率的影响。结果表明，这几种吸附剂无论是单独使用还是两两组合使用，其回收率相差不大，但PSA 和氨基组合使用时，其基质效应是最小的，原因可能是，PSA 主要去除提取液中的脂类和糖类物质，氨基对提取液中的弱酸性物质吸附性强，两者组合使用净化效果更好。

吸附剂用量的优化。比较了50～400 mg PSA 与50～400 mg氨基按不同比例组合时的净化效果。结果表明，200 mg PSA 与100 mg 氨基组合时提取液颜色最浅、净化效果最好，基质效应最小。

3 方法学考察

3.1 基质效应

参考相关文献[15]，试验通过比较空白基质匹配标准溶液中待测物质的峰面积（A1）与溶剂标准溶液中待测物质的峰面积（A2）的大小来评估方法的基质效应：当两者的比值(A1/A2)等于1 时，表明没有基质影响；当两者比值小于1 时，表明有基质抑制效应；当两者比值大于1 时，表明有基质增强效应。具体方法：取空白饲料样品，按1.3步骤进行处理，最后用浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的标准溶液复溶，制得基质匹配标准溶液，同时配制相同浓度的溶剂标准溶液，比较两种标准溶液中待测物质的峰面积，结果见表2。从表2可以看到比值均大于1，表明该法测定饲料样品中的阿奇霉素存在基质增强效应，而且低浓度时的基质效应要强于高浓度时。为抵消基质效应的影响，本试验用基质匹配的标准溶液进行定量。

表2 阿奇霉素的基质效应

3.2 线性关系和检出限

取空白配合饲料样品，按1.3步骤进行处理，待氮吹干后，用1 mL 系列浓度的标准溶液复溶，配制成浓度在1～50 μg/L 范围内的基质标准曲线溶液，进超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定；以阿奇霉素的浓度为横坐标，以其定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。用上述同样的方法，配制浓度逐步降低的基质标准溶液，直到获得目标化合物的信噪比等于10的浓度，确定为该化合物的定量限（LOQ）。阿奇霉素的线性关系及定量限见表3。结果表明，阿奇霉素在1～50 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（r2）为0.999 1，定量限为2.0 μg/kg

表3 阿奇霉的线性范围、线性方程、相关系数和定量限

3.3 回收率和精密度

用经测定不含有阿奇霉素的配合饲料作为空白样品，添加3 个质量浓度水平（分别为LOQ、2LOQ、4LOQ），按照1.3 步骤进行处理，每个水平做6 个平行样，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表4。从表4 可以看出，阿奇霉素的平均加标回收率在75%～90%之间，相对标准偏差在4.3%～8.7%之间。

表4 复合饲料中阿奇霉素的加标回收率和相对标准偏差

4 样品检测

从市场上随机购买30 份配合饲料（6 份产蛋鸡配合饲料、6 份肉鸡配合饲料、6 份鸭配合饲料、6 份猪配合饲料和6 份牛羊配合饲料），应用本试验建立的方法进行测定，其中有1 份产蛋鸡配合饲料检出阿奇霉素，含量为5.2 μg/kg，其余样品均未检出。为了验证该方法，应用龚兰等[11]建立的“固相萃取净化/高效液相色谱一串联质谱测定饲料中7 种大环内酯类药物含量”的方法对上述阳性样品进行了检测，检出结果为5.5 μg/kg。

5 结论

试验采用改良的QuEChERS 法对样品进行处理，并结合超高效液相色谱-串联质谱仪，建立了配合饲料中阿奇霉素残留量的检测方法。试验过程中系统优化了色谱条件、质谱条件、提取溶剂以及净化条件等；除此之外，为验证方法的适用性，还具体考察了方法的基质效应、线性关系、回收率和精密度。结果表明，所建立的方法操作简单，省时省力，提取回收率高，重复性好，满足兽药残留分析的要求，可以为饲料质量安全监督及饲料安全检测标准体系的完善提供技术支持。