基于嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7的资生肾气丸镇痛机制研究

李文昊 任鹏鹏 韩洁茹 常佳怡 解 颖 陈 飞 李富震 姜德友

(1 黑龙江中医药大学,哈尔滨,150040; 2 哈尔滨医科大学附属第一医院中西医结合科,哈尔滨,150000)

痛风性关节炎(Gouty Arthritis,GA)是尿酸钠晶体沉积所引起的一种严重疼痛性关节炎[1],其急性发作被认为是最痛苦的症状之一,与分娩或内脏绞痛同等程度[2]。即使是晚期痛风患者也常常表现为慢性关节疼痛、肿胀、运动受限和痛风复发。资生肾气丸(Zisheng Shenqi Decoction,ZSD)是姜德友教授经过多年研究,结合临床实践,创制的纯中药复方。具有补肾利湿、标本兼顾之功,前期的临床观察、网络药理学及实验研究已初步证实ZSD治疗GA疼痛及炎症反应具有显著的改善作用[3-6],可能与P2X7R/NLRP3/NEK7信号通路及COX-2/PGE2信号通路有关[7-8]。

NOD样受体蛋白3[Nucleotide Binding Domain(NOD)-like Receptor Protein 3,NLRP3]是GA炎症反应的主要参与者,近年来研究发现其与嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7(Purinergic Receptor P2X,Ligand-gated Ion Channel 7,P2X7R)、NIMA相关激酶7(NIMA-related Kinase 7,NEK7)的关系密切[9-10],三者在GA疼痛及炎症反应的发作中起到关键作用,但具体机制尚不清楚。因此,为了进一步探索ZSD对GA疼痛的具体调控机制,本实验采用小鼠冰醋酸扭体致痛模型复制疼痛反应,观察小鼠扭体次数,计算其扭体抑制率,并且应用酶联免疫吸附技术)检测相关疼痛因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)含量,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测P2X7R/NLRP3/NEK7信号通路中mRNA的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 体质量18～22 g的健康雄性C57BL/6小鼠42只,6～8周龄,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号SCXK(辽)2015-0001。动物实验室为高清洁级,饲养温度(22±1)℃,相对湿度45%～55%,通风条件良好,室内自然光照,符合《GB 14925-2010实验动物环境及设施》要求[11]。

1.1.2 药物 ZSD处方由熟地黄、山药、茯苓、牡丹皮、怀牛膝、土茯苓等组成[7],方中药材从黑龙江中医药大学附属第一医院中药房一次性选购。痛风舒片(湖北绿金子药业有限责任公司,批号:140301),吲哚美辛(阿拉丁,批号:CAS53-86-1),冰醋酸(阿拉丁,批号:CAS64-19-7)。

1.1.3 试剂与仪器 IL-1β酶联免疫吸附试验检测试剂(武汉优尔生公司，货号：SEA563Mu)；PGE2酶联免疫吸附试验检测试剂盒(武汉优尔生公司，货号：MEA538Ge)；NGF酶联免疫吸附试验检测试剂盒(武汉优尔生公司，货号:SEA105Mu);酶标仪(BIOTEK公司,美国,型号:ELX-800);电热恒温培养箱(天津泰斯特公司,型号:DH36001B);实时PCR仪(BIONEER公司,韩国,型号:Exicycler 96)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 42只雄性C57BL/6小鼠适应性喂养1周后,随机分为7组,即空白组、模型组、痛风舒对照组、吲哚美辛对照组,ZSD低剂量组、ZSD中剂量组、ZSD高剂量组,每组6只。模型制备:除空白组外,其余各组小鼠分别腹腔注射0.6%冰醋酸生理盐水溶液0.2 mL/只[12],空白组注射等量生理盐水。分别观察并记录注射冰醋酸后10 min、15 min、20 min内小鼠的扭体次数,小鼠出现腹部内凹、身体扭曲、躯干与后腿伸展、臀部高起、蠕行反应为扭体反应[13],出现任意一项计为1次。

末次记录各组小鼠扭体次数后,以心脏采血法采集小鼠外周血。先将小鼠以7%水合氯醛腹腔注射麻醉,打开胸腔,暴露心脏,用一次性采血针针头刺入右心室,吸取3.5 mL血液,并移入以小鼠组别编号的离心管内,静置1 h,625×g离心10 min,取上清液,移入对应编号的EP管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 给药方法 已知成年人标准体质量为70 kg,ZSD方中药物总重量为225 g,即成年人1 d口服用量。根据徐叔云等主编的《药理实验方法学》可知[14],小鼠每日灌胃剂量约是成年人每日服用量的9.1倍。由此可知,痛风舒对照组给予痛风舒片混悬液0.26 g/kg;吲哚美辛对照组给予吲哚美辛溶液9.75 mg/kg;按照低∶中∶高=1∶2∶4比例计算[15];ZSD低剂量组、ZSD中剂量组、ZSD高剂量组分别给药1.5 g/mL、3 g/mL、6 g/mL,依据小鼠每日的体质量变化给药。空白组及模型组用等体积蒸馏水灌胃。各组均于造模前6 d开始给相应的药物或给蒸馏水灌胃,2次/d,连续7 d,末次给药1 h后造模。

1.2.3 检测指标与方法 1)对小鼠一般状态的观察:观察各组小鼠摄食、饮水、体质量、排泄、活动及精神状态等一般情况。2)统计小鼠扭体次数并计算小鼠扭体抑制率:扭体抑制率(%)=(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100%[16]。3)酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中IL-1β、PGE2、NGF、P物质、5-羟色胺的表达:酶联免疫吸附试验试剂按标签说明2～8 ℃储存,使用前恢复到室温,并充分摇匀,以避免试剂产生泡沫,造成浪费,按照试剂盒说明书进行操作。4)RT-PCR检测小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达:a.提取总RNA。b.RNA浓度检测:使用紫外分光光度计NANO 2000测定各样本中RNA的浓度。c.反转录,引物的合成与设计,引物由金斯瑞生物科技有限公司根据Primer Premier 5软件合成,引物序列见表1。

表1 扩增各靶基因的引物序列

1.3 统计学方法 全部数据使用IBM SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料若满足正态性和方差齐性,则应用单因素ANOVA;不满足正态性和方差齐性时给予非参数检验中Kruskal-WallisH检验,P<0.05为差异有统计学意义;多组比较,数据满足正态性和方差齐性时,采用单因素方差分析,不满足正态性和方差齐性时采用非参数检验中Kruskal-WallisH检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZSD对小鼠灌胃后的一般情况的影响 除空白组、模型组一般情况良好外,吲哚美辛对照组中部分小鼠逐渐出现饮食、饮水减少,腹泻,精神萎靡,毛发暗淡无光,活动减少等表现。痛风舒对照组中部分小鼠亦逐渐出现精神萎顿,活动减少表现。ZSD各剂量组小鼠饮食及二便皆正常,活动灵活,精神饱满,尤其以ZSD高剂量组中小鼠的一般情况最佳。

2.2 ZSD对冰醋酸致小鼠扭体反应次数以及扭体抑制率的影响 与模型组比较,在10 min及15 min时,吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及ZSD高剂量组中扭体次数显著降低(P<0.05),扭体抑制率均明显升高(均P<0.05);在20 min时,ZSD低剂量组及ZSD中剂量组的扭体次数亦降低(P<0.05),扭体抑制率亦升高(P<0.05)。与吲哚美辛对照组比较,在10 min及15 min时,ZSD低剂量组扭体次数较高(P<0.05),扭体抑制率降低(P<0.05),而ZSD中剂量组及ZSD高剂量组差异无统计学意义(P>0.05);在20 min时,ZSD各剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1A 各组小鼠不同时间点的扭体次数 图1B 各组小鼠不同时间点的扭体抑制率注:空白组中小鼠各时间点的扭体反应次数为0,扭体抑制率为100%,不参与比较;与模型组比较,*P<0.05;与吲哚美辛对照组比较,△P<0.05

2.3 ZSD对小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF表达的影响 与空白组比较,模型组中IL-1β、PGE2、NGF的表达均明显升高(均P<0.05)。与模型组比较,吲哚美辛对照组、痛风舒对照组、ZSD中剂量组及ZSD高剂量组中IL-1β及PGE2的表达均下降(均P<0.05);吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及ZSD高剂量组中NGF的表达亦下降明显(P<0.05)。与吲哚美辛对照组比较,ZSD低剂量组及ZSD中剂量组中IL-1β、PGE2表达差异有统计学意义(P<0.05),痛风舒对照组及ZSD高剂量组则没有差异;ZSD低剂量组中NGF的表达差异有统计学意义(P<0.05),其他用药组则差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF的表达情况

2.4 ZSD对P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表达的影响 与空白组比较,模型组中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达量均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及ZSD高剂量组中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达均降低(均P<0.05)。与吲哚美辛对照组比较,痛风舒对照组中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表达降低,ZSD低剂量组及ZSD中剂量组3者的表达均升高(均P<0.05),但ZSD高剂量组3者的表达差异无统计学意义(P>0.05)。各给药观察组中,痛风舒片、ZSD高剂量及吲哚美辛均可明显降低小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达,其中ZSD高剂量与吲哚美辛疗效相近,而ZSD低剂量、中剂量疗效不明显。见图2。

图2 各组小鼠P2X7RmRNA、NLRP3mRNA及NEK7mRNA的表达情况注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与吲哚美辛对照组比较,▲P<0.05

3 讨论

3.1 ZSD对小鼠扭体次数及扭体抑制率的影响 根据实验数据可得,各组治疗药物均能降低小鼠扭体次数,增加扭体抑制率,达到镇痛效果。进一步分析扭体抑制率可知,在15 min时,ZSD低剂量、中剂量的扭体抑制率比10 min时略有降低,而在20 min时明显升高。并且在20 min时,与模型组比较,ZSD各剂量组的扭体次数均显著降低,扭体抑制率显著增高。但在20 min时,ZSD各剂量均具有明显的镇痛作用,其疗效与痛风舒片及吲哚美辛相近。

3.2 ZSD对多种疼痛因子的调控作用 随着炎症细胞中NLRP3炎症小体激活,作为疼痛和炎症反应核心的IL-1β被释放如细胞外及血液中,诱导并产生更多的炎症介质及趋化因子[17]。临床研究发现,GA患者的疼痛与IL-1β、IL-6、IL-8的水平正相关[18]。在与GA相似的骨关节炎的研究中,亦发现外周血白细胞中IL-1β基因的高表达与疼痛增加相关[19],并且IL-1β与关节炎缓解后疼痛的持续或复发有关[20]。IL-1β亦可通过向下丘脑发出炎症疼痛信号参与传入疼痛反应,促进痛觉过敏[21],并诱导下丘脑产生PGE2。最新研究表明PGE2亦与GA的疼痛机制相关[22],其可通过致敏和兴奋作用与组胺、缓激肽协同作用,增强组织对疼痛递质和因子的敏感性,从而引起疼痛并加重疼痛[23-24]。除PGE2外,NGF亦与关节疼痛及关节软骨细胞和滑液中的炎症有关[25-26]。有学者在人类细胞培养中发现IL-1β对正常和骨关节炎成纤维细胞的NGFmRNA和蛋白的表达具有调控作用[27]。

本实验发现模型组组小鼠血清中IL-1β、PGE2及NGF表达明显高于空白组,提示IL-1β、PGE2及NGF与小鼠疼痛反应密切相关。与模型组比较,吲哚美辛对照组、痛风舒对照组及ZSD高剂量组的药物均能够明显下调IL-1β、PGE2及NGF的表达。由此可知,ZSD可通过下调IL-1β、PGE2及NGF的表达发挥镇痛作用。在ZSD各剂量组中,以ZSD高剂量下调IL-1β及PGE2的效果最佳。

3.3 ZSD对P2X7R、NLRP3、NEK7的调控作用 通过国内外研究可知,在免疫系统激活的条件下,细胞释放ATP,ATP通过P2X7R促进细胞内外离子环境改变[28],进而调控NEK7、NLRP3的表达,促进IL-1β等炎症介质及疼痛介质的分泌,从而引起炎症反应及疼痛[10]。本研究进一步发现,模型组中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达均明显高于空白组,可知在醋酸致小鼠扭体模型中,P2X7R、NLRP3、NEK7均在转录水平参与疼痛反应。而吲哚美辛、痛风舒片及ZSD各剂量在转录水平上对P2X7R、NLRP3、NEK7具有调控作用。研究亦发现,与ZSD低剂量、中剂量比较,ZSD高剂量对P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的调控作用更强。结合扭体次数及扭体抑制率结果可推测,ZSD高剂量的镇痛效果更佳,疗效与吲哚美辛及痛风舒片相近,这提示ZSD高剂量对小鼠疼痛反应的抑制作用更强有关。

值得一提的是,通过观察小鼠的一般情况发现,吲哚美辛对照组中小鼠出现诸多消化系统异常的症状,如大便偏稀,毛色暗淡,精神萎顿等表现,可见虽然吲哚美辛镇痛效果显著,但其不良反应明显。痛风舒对照组中小鼠亦出现明显的精神倦怠表现,这可能与痛风舒片的功效侧重清热利湿,忽略补益脾肾有关。而ZSD各剂量组小鼠的饮食、排泄均无异常,且精神饱满,尤其以ZSD高剂量组的一般情况最佳,可见ZSD扶正祛邪,标本同治之功强于痛风舒片及吲哚美辛。

综上所述,在醋酸致小鼠扭体模型中,ZSD降低小鼠扭体次数,提高扭体抑制率从而发挥镇痛效果的机制可能与其在转录水平调控P2X7R/NLRP3/NEK7信号通路,抑制P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达,进一步下调IL-1β、PGE2及NGF的表达有关。且ZSD对扭体小鼠的镇痛效果呈剂量依赖性增加,与ZSD低剂量、中剂量比较,ZSD高剂量的镇痛效果更佳,且无不良反应。因此,在ZSD高剂量镇痛效果与吲哚美辛及痛风舒片相近的条件下,选择ZSD治疗GA更加符合临床实践。这一发现可为ZSD调控GA疼痛机制的深入研究提供理论依据。

利益冲突声明:无。