通心痹合剂对动脉粥样硬化家兔血管内皮损伤及炎症反应的影响及其作用机制

汪满意 王道成 马小东 薛 刚 屈长宏 严士海 朱萱萱

(1 扬州大学医学院,扬州,225009; 2 南京中医药大学扬州附属医院心血管内科,扬州,225009; 3 江苏省中医院药剂科,南京,210029)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种脂质浸润驱动的大、中血管慢性炎症病变,是多种心脑血管疾病的病理基础[1]。中医古籍中虽未见关于AS的论述,但结合其症状可将其归属于中医“胸痹”“中风”等范畴。中医药防治AS不稳定斑块主要从毒邪、内虚外毒、络病理论等方面进行研究,相关分子机制主要围绕脂质浸润、损伤反应、氧化应激及炎症等经典学说进行深入研究[2]。本研究团队认为易损斑块的形成可能与痰瘀等有形之邪相关,易损斑块的破裂可能与热毒等无形之邪相关,在此理论指导下拟通心痹合剂应用于临床治疗AS患者,疗效甚佳。前期研究表明,通心痹合剂能明显缩短冠心病心绞痛患者发作持续时间、减少发作次数,其作用机制可能是通过抗炎、抗氧化、调节脂质代谢以达到防治冠心病目的[3];临床研究发现其具有改善其内皮细胞损伤、抑制血小板活化的作用[4-5];动物实验研究显示,调节血脂和降低炎症介质水平可能是通心痹合剂抗AS的作用机制之一[6-7]。但其保护血管内皮、抗炎的作用机制仍不清楚,为了研究通心痹合剂对AS的可能作用,故本研究拟在前期研究的基础上,观察通心痹合剂对血管内皮保护的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康的雄性家兔,体质量2.0～2.5 kg,由南京江宁区青龙山动物繁殖场提供。合格证号:SCXK(苏)2017-0001。在严格遵循动物伦理学标准的前提下进行实验(伦理审批号:2021-19)。动物饲养环境:室内温度18～25 ℃,室内相对湿度40%～70%。对照组饲喂普通饲料100 g/d,实验动物饲喂高脂饲料100 g/d(1%胆固醇+5%蛋黄+5%猪油+89%普通饲料)。自然昼夜循环。

1.1.2 药物 通心痹合剂(金银花30 g、当归20 g、玄参30 g、瓜蒌皮12 g、川芎10 g、水蛭6 g研末、黄精30 g)药物均出自道地药材:金银花产自河南,当归产自甘肃,玄参产自浙江,瓜蒌皮产自山东,川芎产自四川,水蛭产自浙江,黄精产自广东。以上药物经扬州市中医院廖建春主任药师鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》质量规定、由扬州市中医院制剂室统一提供,制备方法(统一标准):先将生药浸入清水中浸泡30 min,然后煎煮1 h,再留取滤液备用,再煎1 h并过滤后留取合并滤液,将前后2次煎煮药液混合、离心、去除沉淀,上清液即药汁,经80 ℃水浴锅蒸发浓缩处理,配制生药含量1.84 g/mL的中药汤剂,灭菌后4 ℃冷藏保存。辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司,国药准字H19990366)。

1.1.3 试剂与仪器 内皮肽试剂盒(BP公司,美国,生产批号:20130215TRP);一氧化氮试剂盒(BP公司,美国,生产批号:20130210RW);VEGF试剂盒(Abcam公司,英国,生产批号:GR66352-1);基质金属蛋白酶-9试剂盒(Santa Cruz公司,美国,生产批号:4599R);核因子κB抗体(Bioworld公司,美国,生产批号:130402R);BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京天根生物科技有限公司,生产批号:PA115-01);核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASC)、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1、β-肌动蛋白一抗(Abcam公司,英国,生产批号分别为:ab4207、ab226191、ab238972、ab9485、ab8227)。全自动生化分析仪(Beckman Coulter有限公司,美国,型号:Au481-10);球囊导管(Dedwards Lifesciences,美国,型号:59219817);离心机(北京京立离心机有限公司,型号:LDZ-5);紫外线分光光度计(上海光谱仪器有限公司,型号:756PC)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将健康雄性家兔随机分为对照组和模型组。对照组(10只)家兔正常饲养4周。模型组家兔给予高脂饲料100 g/d饲养2周,应用颈动脉球囊拉伤术损伤造模加饲喂高脂饲料2周[8]。4周后评估造模情况,取2只观察组家兔经主动脉根部苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色,若脂质斑块形成,确定造模成功。将造模成功的50只家兔随机分为模型组、辛伐他汀组、通心痹合剂大剂量组、通心痹合剂中剂量组、通心痹合剂小剂量组,每组10只。

1.2.2 给药方法 辛伐他汀组按照1.33 mg/kg(2 mL/kg)辛伐他汀片灌胃;通心痹合剂大剂量组按照9.87 g/kg(2 mL/kg)灌胃,通心痹合剂中剂量组按照4.93 g/kg(2 mL/kg)灌胃,通心痹合剂小剂量组按照2.47 g/kg(2 mL/kg)灌胃(中剂量来自于临床等效剂量的换算,小剂量、大剂量分别为中剂量的0.5倍、1.5倍);对照组和模型组灌胃等体积生理盐水(2 mL/kg),1次/d。连续给药8周。对照组饲喂普通饲料,其余组高脂饲料喂养。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 标本获取 实验结束时经家兔耳缘静脉采血2 mL,3 000 r/min离心10 min后取血清(离心半径10 cm),放入-80 ℃冰箱冷藏备用。无菌条件下解剖家兔,取其主动脉,一部分常规4%多聚甲醛固定,石蜡包埋用于组织学分析;另一部分新鲜组织离体后液氮冷冻,用于相关蛋白检测。

1.2.3.2 全自动生化仪测定血脂 用全自动生化分析仪检测总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平。

1.2.3.3 酶联免疫吸附试验法检测血清内皮肽、一氧化氮水平 具体方法严格按试剂盒说明操作。

1.2.3.4 半定量法测定血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2、核因子κB的阳性细胞数 采用半定量法判断,即根据每张切片的阳性细胞的面积及着色强度进行分级评分,二者乘积的积分进行统计分析。每个视野所见阳性细胞数的面积分0级(阴性,0分)、1级(阳性细胞占1%～25%,1分)、2级(阳性细胞占26%～50%,2分)、3级(阳性细胞占51%～75%,3分)、4级(阳性细胞占76%～100%,4分),着色强度计分标准为:0分(无着色)、1分(浅黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)。

1.2.3.5 免疫组织化学法检测主动脉组织中血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB蛋白的表达水平 将备用切片预热后脱蜡、梯度乙醇脱水;进行抗原修复;再于3% H2O2去离子水中孵育以消除内源过氧化物酶活性;分别用SP试剂盒中3种试剂进行孵育并冲洗;最后用DAB显色剂显色;树脂封片。免疫组织化学染色阳性,可见细胞核内出现棕黄色颗粒。应用图像全自动分析系统,对每张免疫组织化学玻片阳性目标出现最多的区域随机挑选5个视野(×200),求得阳性单位(Positive Unit,PU)值。

1.2.3.6 蛋白免疫印迹检测主动脉组织中NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表达水平 取适量主动脉组织,利用蛋白裂解液裂解组织提取组织总蛋白,配置制备BCA工作液(稀释对照品A∶B为50∶1),取6组各6个样品及各浓度标准品100 μL,加入EP管中,根据说明书提取、测定蛋白浓度。将蛋白与适量上样缓冲液的混合液加热变性后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSpolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分离,转膜后封闭1 h(5%脱脂奶粉),加一抗(1∶3 000,4 ℃,过夜),TEST洗膜3次后二抗(1∶5 000,室温,1 h)。孵育完成洗膜3次。以β-肌动蛋白为内参照,根据ECL发光法记录曝光图片,分析条带灰度值。

2 结果

2.1 通心痹合剂对AS家兔血脂的影响 与对照组比较,模型组总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇均明显升高,高密度脂蛋白胆固醇下降,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,辛伐他汀组、通心痹合剂各剂量组均可明显降低家兔血液中的总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇,升高高密度脂蛋白胆固醇,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 通心痹合剂对AS家兔血脂的影响

2.2 对血管内皮内皮肽、一氧化氮的影响 与对照组家兔比较,模型组家兔血液中的内皮肽浓度升高(P<0.05)。与模型组家兔比较,经过药物治疗后,通心痹合剂各剂量组家兔血液中的内皮肽浓度降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组一氧化氮显著下降(P<0.05);辛伐他汀组和通心痹合剂各组较模型组明显升高(P<0.01)。见表2。

表2 通心痹合剂对家兔内皮肽、一氧化氮的影响

2.3 半定量法测定血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB的阳性细胞计数 与对照组比较,模型组血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB均明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；给予相应药物干预后，通心痹合剂各剂量组、辛伐他汀组血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB表达均明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9和核因子κB测定结果

2.4 免疫组织化学法检测兔主动脉血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB的水平

通心痹合剂各剂量组、辛伐他汀组血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB表达均明显减弱。见图1～3。

图1 通心痹合剂对AS家兔血管内皮生长因子表达的影响(免疫组织化学,×200)注:各组家兔血管内皮生长因子蛋白表达的免疫组织化学检测结果(阳性表达为棕色颗粒)

2.4.1 通心痹合剂对AS家兔血管内皮生长因子蛋白表达水平的影响 模型组兔血管内皮生长因子的表达明显增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);给予相应药物干预之后,通心痹合剂高剂量组、通心痹合中剂量组、通心痹合剂低剂量组和辛伐他汀组兔血管内皮生长因子表达都明显减弱,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见图1。

2.4.2 通心痹合剂对AS家兔基质金属蛋白酶-9蛋白表达水平的影响 与对照组比较,模型组家兔主动脉组织中基质金属蛋白酶-9蛋白的表达水平明显升高,表现为深棕黄色,呈强阳性表达,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,辛伐他汀组和通心痹合剂高剂量组、通心痹合剂中剂量组主动脉组织中基质金属蛋白酶-9蛋白的表达水平有不同程度的降低,呈弱阳性表达,差异有统计学意义(P<0.05),通心痹合剂小剂量组兔主动脉中基质金属蛋白酶-9表达明显,主动脉全层均表现为棕黄色,呈阳性表达,差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 通心痹合剂对AS家兔基质金属蛋白酶-9表达的影响(免疫组织化学,×200)注:各组家兔基质金属蛋白酶-9蛋白表达的免疫组织化学检测结果(阳性表达为棕色颗粒)

2.4.3 通心痹合剂对AS家兔核因子κB蛋白表达水平的影响 与对照组比较,模型组家兔主动脉组织中核因子κB蛋白的表达水平明显升高,表现为深棕黄色,强阳性表达,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,辛伐他汀组和通心痹合剂大剂量组、通心痹合剂中剂量组主动脉组织中核因子κB蛋白的表达水平有不同程度的降低,弱阳性表达,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),通心痹合剂小剂量组兔主动脉中核因子κB表达明显,主动脉全层均表现为棕黄色,阳性表达,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 通心痹合剂对AS家兔核因子κB表达的影响(免疫组织化学,×200)注:各组家兔核因子κB蛋白表达的免疫组织化学检测结果(阳性表达为棕色颗粒)

2.5 通心痹合剂对AS家兔主动脉斑块核因子κB-NLRP3通路相关蛋白的影响 与对照组比较,模型组NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,通心痹合剂各剂量组、辛伐他汀组NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表4。

图4 各组家兔主动脉斑块核因子κB/NLRP3通路相关蛋白质印迹法检测结果

表4 各组家兔主动脉斑块核因子κB/NLRP3通路相关蛋白表达比较

3 讨论

AS是一种由多因素引起的发生在动脉壁的慢性炎症病变[9]。研究表明,冠心病临床表现形式与斑块的稳定性直接相关[10-11]。临床试验表明,抗炎治疗可降低冠心病患者AS事件风险[12]。在人和动物体内的炎症部位及AS损伤区域都可检测到内皮细胞功能障碍。出现功能障碍的内皮细胞对血液中的低密度脂蛋白通透性增加。低密度脂蛋白被氧化成氧化型低密度脂蛋白就成为与损伤相关的分子模式,破坏内皮细胞并触发炎症反应[13]。而基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子的检测可明确AS斑块性质,反映斑块稳定性及病变程度[14]。其作用机制为血管内皮生长因子刺激血管内皮细胞,引起基质金属蛋白酶-9等基因及蛋白表达上调,进而有可能促进AS斑块内基质降解,引起斑块破裂[15]。

炎症小体在机体炎症反应中发挥重要作用,NLRP3炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体,其识别炎症的受体为核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族NLRP3[16],由ASC、NLRP3、效应蛋白半胱天冬酶-1前体3部分组成。就AS分子机制而言,目前已有研究表明[17],NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3、ASC、胱天蛋白酶-1在不稳定性斑块中的表达要显著高于稳定性斑块。核因子κB是控制NLRP3表达的关键转录因子信号通路,在NLRP3基因启动子区有3个核因子κB的结合位点,其对于NLRP3基因转录是必需的[18]。当NLRP3受到上游核因子κB信号刺激时,可上调炎症反应基因表达、促进炎症反应。因此抑制NLRP3炎症小体激活,可显著抑制炎症通路,改善AS的进展及预后。

研究发现,“炎症学说”与“瘀毒内结”存在紧密联系,血栓形成、脂质浸润、炎症反应、细胞焦亡等病理过程均与中医内毒理论相符合[19-20]。AS在中医理论中的病理变化为脉道不利,《金匮要略心典》载“无邪不有毒,热从毒化,变从毒起,瘀从毒结”,痰毒、瘀毒阻碍气机,郁久则化为热毒,耗伤心阴,不通或不荣则痛,发为胸痹。因此,易损斑块的形成可能与痰瘀等有形之邪相关,易损斑块的破裂可能与热毒等无形之邪相关。毒在上焦者当清解之,故针对胸痹毒邪理论立以“清热解毒、活血化痰、益气养阴”之法,创“通心痹合剂”应用于临床。通心痹合剂是由“四妙勇安汤”加减而成,原方为治疗热毒型脱疽的一则著名古方,近年来临床应用中发现其具有抗AS作用。本课题组基于对AS上述病机的认识,在原方基础上方加瓜蒌皮、川芎、水蛭、黄精,临床疗效显著。本方以金银花、玄参为君药,清热解毒,滋阴凉血,当归补血而主动,活血而不伤新血,瓜蒌皮清热化痰、宽胸散结,二药共为臣药,川芎、水蛭活血化瘀通络,黄精气阴双补,乃共为佐药。全方清热解毒、活血化痰、益气养阴,且清而不燥、寒而不凝、润而不腻、滋而能通,共奏通络之效。

本实验中采用高脂喂养加颈动脉球囊拉伤术来加速诱导家兔AS形成的过程,并将模型组家兔的血脂、主动脉表达血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、核因子κB蛋白的变化、核因子κB/NLRP3炎症小体信号通路等指标的检测结果与对照组比较,结果表明,本实验AS模型造模成功。通过模型组与药物处理动物对比发现,与辛伐他汀作用类似,方中水蛭可能通过减少脂质浸润,抑制内膜增厚,减缓AS的进展,川芎能减小斑块面积,从而发挥抗AS的作用[21-22]。检测核因子κB/NLRP3通路相关蛋白发现,模型组家兔主动脉组织中核因子κB、NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表达水平明显升高,说明核因子κB/NLRP3通路参与AS炎症的发展。与模型组比较,通心痹合剂明显降低核因子κB、NLRP3、ASC、原胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-1蛋白的表达,提示通心痹合剂可抑制核因子κB/NLRP3通路调控的炎症反应,缓解AS的发展。单一通路对疾病的阐释较为局限,已有研究从核转录因子红系2相关因子2/血红素加氧酶-1通路的角度对本病进行阐释[23-24]。动物实验仅从相关指标表达及病理变化角度进行探讨,今后仍需要从分子、基因及临床试验等进一步揭示其作用靶点与机制。

利益冲突声明:无。