基于网络药理学研究四物汤对阿尔茨海默病的作用机制及实验验证

张秀文 魏明清 倪敬年 李 婷 时 晶 田金洲

(北京中医药大学东直门医院,北京,100700)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是一种慢性进行性的神经退行性疾病,是导致痴呆的最常见的原因,占痴呆患者总数的60%～80%[1]。2019年国际阿尔茨海默病协会估计:全世界有超过5 000万的痴呆症患者,到2050年将增加到1.52亿[2]。随着老龄化社会的到来,预测2030年我国的患病人数将超过2 000万[3]。这将给社会、医疗和家庭带来沉重的负担。同时,AD的发病机制尚未完全明确,目前已知的发病机制有β淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)异常沉积、tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结(Neurofibrillary Tangles,NFTs)、神经炎症反应、线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞凋亡等[4]。但不幸的是,针对单一发病机制的一系列药物研究在临床试验阶段都没有获得很好的临床效果[5-7]。故而目前认为AD是由多因素共同作用引起的,治疗也应当针对多种因素进行多靶点治疗。

中医以整体观念和辨证论治为基本特点,是一种多靶点治疗的方法,随着近年来国外药物研究的失败,中医疗法受到了广大医务工作者的关注。阿尔茨海默病是由髓减脑消、神机失用所导致的神智异常疾病,属于中医学的“痴呆病”,临床以呆傻愚笨、智力低下、善忘等为主要表现[8],病性为本虚标实,本虚在于肾精不足,标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍[9]。《阿尔茨海默病的中医诊疗共识》指出AD早期以肾虚为主;中期痰、瘀、火并现;晚期为痰、瘀、火日久而化生毒浊所致,治疗方面当遵循补肾原则,分期辨证治疗[10]。四物汤,出自宋代的《太平惠民和剂局方》,主要记载用于妇产科疾病,主要作用为补血和活血,由熟地黄、白芍、当归、川芎等中药组成,逐渐被后世医家认为“可治一切血证”“血证立法”。基于现代药理研究和临床应用研究,基于“虚”“瘀”的病机,四物汤被认为可用于多类病的治疗[11]。

本文探析从“血”论治AD的理论依据,并利用网络药理学方法对“调理一切血证”的四物汤用于AD的作用机制进行全面研究[12],为后续研究的开展提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞株)(由北京中医药大学东直门医院实验室提供)。

1.1.2 药品 四物颗粒(吉泰安,批号:Z20020016);盐酸多奈哌齐片(安理申,批号:H20050978)。

1.1.3 试剂与仪器 人工合成Amyloid Peptide 25-35(Aβ25-35)(万生昊天,型号:C-PT0104220301),高糖培养基(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium,DMEM)(HyClone,美国,货号:SH40007.01),澳洲胎牛血清(Gibco,美国,货号:10099-141),青-链霉素溶液(Gibco,美国,货号:15140-122),BCA试剂盒(碧云天,货号:P0012),CCK-8检测试剂盒(日本同仁化工,日本,货号:CK04),聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)(Millipore,美国,货号:IPFL00010),B细胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)抗体(ABclonal,货号:WH260030),二抗(Abcam,美国,货号:ab6702),CO2恒湿培养箱(Esco,新加坡,型号:170L),离心机(Eppendorf,德国,型号:5804),倒置显微镜(Olympus,日本,型号:CKX41),多功能酶标仪(BioTek,美国,型号:SYNERGY H1)。

1.2 方法

1.2.1 四物汤活性成分筛选 使用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)检索四物汤中白芍、熟地黄、当归、川芎四味中药的所有活性成分。筛选标准为口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30和类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18[13],同时查阅文献,对四物汤的活性成分进行补充。

1.2.2 四物汤“成分-靶点”网络构建 TCMSP数据库获取四物汤中各个中药的活性成分对应的作用靶点信息。通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到四味中药的有效活性成分的标准SMILE号,导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)进行靶点预测,选取Probability≥50%的作用靶点。整合2个数据库所收集到的所有靶点信息并进行去重。通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称,物种选择为“human”。将活性成分和靶点导入Cytoscape 3.7.2软件,构建药物-活性成分-靶点网络。

1.2.3 疾病靶点获取及关键靶点筛选 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和Omim数据库(https://omim.org)中以“Alzheimer′s Disease”为关键词进行检索,在GeneCards数据库检索结果中选择关联分数(Relevance Score)>20的疾病靶点,对最终获得2个数据库中的疾病靶点进行整合并去重。最后通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称。通过微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制四物汤活性成分靶点和阿尔茨海默病靶点的韦恩图。

1.2.4 蛋白质蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络构建 将四物汤与AD的共同靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/),使用“Multiple Proteins”,物种选择“Homo Sapiens”,最低相互作用评价阈值选择“Medium Confidence(0.400)”,并隐藏网络中没有链接的节点,获得潜在靶点的PPI网络。再将获得结果导入Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑学分析并构建核心靶点(Degree值前20)的PPI网络。

1.2.5 基因本体(Gene Ontology,GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用David(https://david.ncifcrf.gov/)对获得的潜在靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,进一步说明四物汤对应的潜在靶点在基因功能和通路中的作用,导出富集分析结果并绘制barplot柱状图和dotplot点图。

1.2.6 分组与模型制备 20 μmol/LAβ25-35干预24 h建立细胞损伤模型,分为对照组(DMEM)、模型组(20 μmol/LAβ25-35)、四物颗粒组(20 μmol/LAβ25-35+四物颗粒1 μg/mL)和多奈哌齐组(20 μmol/LAβ25-35+多奈哌齐100 ng/mL)4组。

1.2.7 干预方法 使用DMEM培养基将四物颗粒与盐酸多奈哌齐片分别稀释为1 μg/mL和100 ng/mL,细胞贴壁后更换为含四物颗粒或盐酸多奈哌齐+20 μmol/LAβ25-35的培养基,干预24 h。

1.2.8 检测指标与方法

1.2.8.1 CCK-8活力检测 取对数生长期的细胞按6 000/孔接种于96孔板中,过夜贴壁后进行分组干预,24 h后每孔加入10 μL的CCK-8试剂,放置于37 ℃恒温,5%CO2恒湿的培养箱中避光孵育1～2 h,使用酶标仪于450 nm波长处读取每孔的吸光度(Optical Density,OD)。

1.2.8.2 蛋白质免疫印迹法检测 细胞中裂解得到的匀浆,置于4 ℃,18 800×g离心20 min,取上清,经BCA试剂盒定量。用12.5%的凝胶电泳(160 V,60 min)分离蛋白,200 mA,80 min转移至PVDF膜,使用快速封闭液封闭1 h,然后在4 ℃与特异性一抗孵育过夜:B细胞淋巴瘤(B cell Lymphoma Protein-2,Bcl-2,1∶1 000。随后使用含吐温1%的TBST清洗3次,10 min/次,然后与二抗(1∶5 000)室温下孵育1 h,然后免疫反应条带可视化,使用分析软件(Bio-Rad)进行分析。

2 结果

2.1 四物汤活性成分筛选 借助TCMSP数据库和查阅文献共搜集白芍化合物13个,熟地黄化合物2个,当归化合物2个,川芎化合物7个,去重后共得19个。见表1。

表1 四物汤各药物活性成分

2.2 药物-活性成分-靶点网络构建 最终获得活性成分靶点269个、白芍138个、熟地黄37个、当归59个、川芎35个,构建药物-活性成分-靶点网络,主要活性成分有植物甾醇、山柰酚和β-谷甾醇等,节点面积越大,Degree值越大。见图1。

图1 四物汤-活性成分-靶点网络注:BS-白芍,CX-川芎,SD-熟地黄,DG-当归;A1-白芍、川芎、熟地黄共有活性成分,A2-白芍、当归共有活性成分,D1-当归、熟地黄共有活性成分

2.3 疾病靶点获取及与四物汤靶点交集预测 获得四物汤靶点151个。获得疾病靶点980个。其中,疾病靶点934个,四物汤作用靶点105个,共有靶点46个。见图2。

图2 四物汤靶点与疾病靶点的韦恩图

2.4 PPI网络构建 共有相互作用连线306条,节点46个,其中浅蓝色线表示从已知数据库得来的,紫色线代表经拓扑学分析获得Degree值前20的核心靶点信息。见图3。其中蛋白激酶B1(V-akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 1,AKT1)、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、JUN原癌基因(JUN Proto-oncogene,JUN)、肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthases 2,PTGS2)为Degree值前5位。见表2、图4。

图3 四物汤和阿尔茨海默病潜在靶点PPI网络

图4 PPI网络核心靶点(Top20)注:由上至下为Degree值由大至小

表2 Degree值前20的核心靶点

2.5 GO富集分析 经富集分析,生物过程(Biological Progress,BP)显著富集在药物反应、雌二醇反应、脂多糖介导的信号通路、神经元凋亡过程的正调控、一氧化氮合成过程的正调控等。见图5。细胞组分(Cellular Component,CC)显著富集在细胞质、小凹、线粒体、细胞膜、轴突、神经元胞体、细胞核、神经元投射等。见图6。分子功能(Molecular Function,MF)显著富集在酶结合、蛋白质同源二聚化活性、血红素结合、激酶活性、药物结合、蛋白复合物结合、蛋白结合、蛋白激酶活性、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程等。见图7。

图6 四物汤GO富集分析细胞组分注:颜色代表P值,红色表示P值显著

图7 四物汤GO富集分析分子功能注:颜色代表P值,红色表示P值显著

2.6 KEGG通路富集分析 与AD密切相关的通路57个,包括TNF信号通路、多巴胺能神经突触、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases,MAPK)信号通路、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡、Toll样受体(Toll-like Receptor,TLRs)信号通路等。见图8。

图8 四物汤KEGG通路富集dotplot点图注:圆点大小代表基因数,圆点面积越大,基因越多;颜色代表P值,红色表示P显著

2.7 四物颗粒对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞活力的影响 与Aβ25-3520 μmol/L组比较,其余3组的细胞活力OD值差异有统计学意义(P<0.05),四物颗粒组与多奈哌齐组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图9。

图9 四物颗粒对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞活力的影响(n=6)注:SWKL四物颗粒;Donepezil多奈哌齐;与对照组比较,△P<0.05;与Aβ25-3520 μmol/L比较,*P<0.05

2.8 四物颗粒对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞Bcl-2的影响 与Aβ25-3520 μmol/L组比较,四物颗粒显著增加Bcl-2的表达(P<0.05),与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图10。

图10 四物颗粒对对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞Bcl-2表达的影响(n=3)注:SWKL四物颗粒;Donepezil多奈哌齐;A.Bcl-2/β-actin量化分析;B.Bcl-2和β-actin代表性蛋白免疫印迹;与对照组比较,△P<0.05;与Aβ25-3520 μmol/L比较,*P<0.05

3 讨论

AD是痴呆最常见的原因之一,临床以认知障碍为特征,记忆障碍最为突出[14]。随着目前针对单一作用机制研发的药物的失败,越来越多的研究者认为AD为多因素共同作用的疾病,包括Aβ异常沉积、tau蛋白过度磷酸、神经炎症反应、线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞凋亡等[4]。因此,目前迫切需要寻找多靶点、多通路的治疗方法。中医的整体观念在这一方面优势明显,田金洲教授以补肾为主,分早(补肾精、益脾气)、中(泻火、祛瘀、化痰)、晚期(解毒通络)辨证治疗痴呆的方式取得了很好的临床效果[15]。这显示了中医在防治AD领域的广阔前景。四物汤是一切血证的立法方剂,活血而不伤血,补血而不滞血,实为AD患者见血虚血瘀证者的良方,研究显示,盐酸多奈哌齐联合以四物汤为立法的养血清脑颗粒比单用盐酸多奈哌齐能够更好地改善患者的记忆力,尤其是在回忆、再认及背数方面,能更有效地提高简易智能状态评定表评分和神经精神症状问卷评分[16-17]。

本研究从TCMSP中得到的主要活性成分有芍药苷、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、儿茶素、亚油酸乙酯、杨梅酮、川芎哚、洋川芎醌等。已有研究显示,芍药苷显著抑制了Aβ25-35诱导的C6质细胞一氧化氮的产生并通过调节核因子κB通路抑制炎症介质的产生[18],从而改善炎症反应。山柰酚在中枢神经系统疾病中有抗氧化作用,并对Aβ的形成和聚集起调节作用[19];川芎哚及其类似物具有一定的降低血液黏度及改善血液流变学的作用[20]。

通过构建PPI网络得到四物汤和AD的46个共同靶点基因,拓扑学分析Degree值前5位的有AKT1、CASP3、JUN、TNF、PTGS2。ARVANITAKIS等[21]研究显示,脑AKT磷酸化与AD的神经病理和认知功能下降有关;CASP3已被确定为神经元细胞死亡的关键中介因子,并被认为是AD早期药物治疗的潜在靶点[22];TNF则是参与神经炎症反应的主要炎症介质;JUN蛋白连接到DNA上组成的JUNB参与细胞生长、细胞增殖、细胞调亡等多种细胞活动[23]。

GO富集分析表明药物反应、丝氨酸肽基磷酸化、脂多糖介导的信号通路、神经元凋亡过程的正调控、一氧化氮合成过程的正调控等多个生物过程与四物汤作用于AD有关。KEGG通路富集分析发现作用靶点主要富集在TNF信号通路、多巴胺能神经突触、MAPK信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡、TLR信号通路等,这表明四物汤对AD的干预是多靶点、多通路的。TLRs和辅受体被激活可诱导Aβ摄取或炎症反应,纤维性Aβ可与TLR2、TLR4和CD14直接作用,在AD开始阶段可以促进对Aβ吞噬作用,但在后期增加或加速神经元凋亡[24],并有研究表明,神经干细胞移植能够抑制APP/PS1转基因小鼠小胶质细胞上TLR4介导的炎症通路激活[25]。MAPK被激活后,可使核因子κB和其他蛋白激酶等多种底物磷酸化,在细胞凋亡过程中起重要作用[26]。黄德弘等[27]研究显示,加味当归芍药散可抑制AD大鼠模型的炎症介质及磷酸化MAPK信号分子的过表达,从而抑制脑内炎症。经细胞实验初步验证显示,四物颗粒能够显著增加Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞模型的活力以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。以上研究表明,四物汤可能通过多靶点介导的多个重要信号通路发挥对AD的治疗作用。

本研究探讨中医“血证”理论防治阿尔茨海默病的理论基础和现代理论依据,发现呆病本质仍是“虚”,瘀血是其不可忽视的主要病理因素之一,所以,虚瘀合证者,补血活血的四物汤是防治呆病的良方。此外,本研究通过网络药理学探索四物汤多成分、多靶点、多通路防治AD的作用机制,发现四物汤的活性成分可能通过抗氧化、抗细胞凋亡、减少炎症反应和保护神经元细胞等机制发挥治疗AD的作用。因此,对四物汤防治AD的深入研究是具有临床意义的,后续需要进一步进行实验验证,为阿尔茨海默病的防治提供新的方法。

利益冲突声明:无。