CXC 趋化因子配体10 对肝细胞癌SMMC-7721 细胞增殖和迁移的影响及其机制

邓文俊, 胡连涛, 赵彬男, 董新宇, 李学斌, 李 杰, 杨馨妍, 郭晓莉, 李 玥,曲义坤, 王伟群

（1.佳木斯大学基础医学院生理学教研室，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江省微生物-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江 佳木斯 154007；4.佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154007；5.佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江 佳木斯 154007）

原发性肝癌目前被认为是全球人类最常见的十大癌症类型之一，患病率位居所有癌症的第4 位，其中90% 以上原发性肝癌为原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］。目前HCC 患者采用的治疗方式相对比较单一，患者在确诊时已大多发展到中晚期，疗效有限，治疗后复发率较高，导致HCC 的高死亡率［2］。因此，寻找HCC 潜在的治疗靶点对其的防治至关重要。CXC 趋化因子 配 体10 （CXC chemokine ligand 10，CXCL10）又称INP10，位于人类第4 号染色体q21 区，能够与受体CXCR3 结合，参与肿瘤的发生发展［3-4］。HCC 组织中CXCL10 表达水平明显高于正常组织，同 时CXCL10 能 够 影 响HCC 患 者 的 预 后［5］，CXCL10 可能成为HCC 治疗的生物标志物，但CXCL10 促进HCC 发展的机制尚不明确。本研究探讨CXCL10 对HCC 细胞增殖和迁移能力的影响及其作用机制，为筛选HCC 的治疗靶点和研究CXCL10 在肿瘤进展中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人HCC SMMC-7721细胞（中国科学院上海细胞库）。RPMI 1640 培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清（以色列BI 公司），胰蛋白酶、CCK-8 增殖试剂盒、EdU-555 细胞增殖试剂盒、结晶紫、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝胶配制试剂盒和ECL 超敏发光液（上海碧云天生物技术有限公司），重组人CXCL10（美国Pepro Tech 公司），脱脂奶粉（美国BD公司），聚偏二氟乙烯（hydrophobic polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜（美国Milipore公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）和辣根过氧化物酶偶联二抗（武汉博士德生物公司），细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）、 磷 酸 化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK） 和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）单克隆抗体（上海Abways 公司），ERK 抑制剂PD98059（美国Selleck 公司），β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥生物公司），蛋白Marker（美国Thermo 公司）。全自动多功能酶标仪（美国BioTek 公司），垂直蛋白电泳仪、转膜仪、图像采集和分析系统（上海天能公司），荧光显微镜（德国Leica公司），CO2培养箱（美国Thermo公司），光学倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 细胞培养和分组SMMC-7721 细胞培养于含10%FBS 和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640 培养基中，每2 d 换液1 次，细胞长至80%密度时，胰蛋白酶消化后传代。细胞按照CXCL10 浓度分为0 mg·L－1CXCL10 组、10 mg·L－1CXCL10 组 和30 mg·L－1CXCL10 组。上述部分细胞给予ERK 抑制剂PD98059（80 μmol·L－1）处理后，将SMMC-7721 细 胞 分 为0 mg·L－1CXCL10+PD98059 组、10 mg·L－1CXCL10+PD98059 组 和 30 mg·L－1CXCL10+PD98059 组。

1.3 CCK-8 法检测各组SMMC-7721 细胞增殖率常规培养SMMC-7721 细胞后，取对数生长期细胞接种于96 孔细胞培养板，接种密度为3×104mL－1，每孔100 μL 培养体系，置于含5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养24 h，细胞贴壁后按照分组加入CXCL10 溶液，每组设5 个复孔，另设空白对照组，37 ℃细胞培养箱孵育24 h 后加入CCK-8 溶液，每孔10 μL，37 ℃温箱避光孵育1 h。酶标仪450 nm 波长处检测各孔吸光度（A）值，计算各组细胞增殖率。细胞增殖率=（处理组细胞A 值/对照组细胞A 值）×100%。

1.4 EdU 法 检测各 组SMMC-7721 细胞 中EdU 阳性表达率取对数生长期细胞接种于24 孔细胞培养板，接种密度为5×104mL－1，每孔500 μL，细胞贴壁后加入CXCL10 溶液，每组设置2 个复孔，置于37 ℃细胞培养箱中孵育24 h；按照说明书，每孔加入500 μL 2×EdU 工作液，37 ℃温箱孵育4 h 后去除培养液，4%多聚甲醛固定15 min，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗涤3 次，通透液室温孵育15 min，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗涤2 次，每孔加入500 μL Click 反应液，室温避光孵育30 min后去除，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗涤3 次，每孔加入500 μL Hoechst 33342 染核，室温避光孵育10 min 后去除染色液，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗涤3×5 min 后采用荧光显微镜观察各组SMMC-7721 细胞中EdU 阳性细胞数，计算EdU 阳性表达率。 EdU 阳 性 表 达 率= （EdU 阳 性 细 胞 数/Hoechst 33342 阳性细胞数）×100%。

1.5 Transwell 小室实验检测各组SMMC-7721 细胞迁移率取2×104个处于对数生长期的SMMC-7721 细胞接种于Transwell 小室上室中，细胞培养于100 μL 无 FBS 的培养基中；下室每孔加入600 μL 含20% FBS 和CXCL10 溶液的培养基，培养48 h 后弃去上室中培养基，PBS 溶液洗涤3 次，棉签擦去上室内未迁移的细胞，0.1%结晶紫染色30 min；三蒸水摇床洗涤后稍晾干，于显微镜下观察和拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=迁移细胞数/细胞总数×100%。

1.6 Western blotting 法检测各组SMMC-7721 细胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表达水平取对数生长期细胞接种于6 孔细胞培养板，CXCL10溶液处理24 h 后提取蛋白，取 20 μg 总蛋白进行10% SDS-PAGE 凝胶中电泳，80 V 恒压使溴酚蓝电泳至浓缩胶与分离胶交界处，待蛋白Marker 出现后改用120 V 电压直至溴酚蓝迁移至凝胶底部；270 mA 电流转膜，使蛋白转移至 PVDF 膜上；采用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液于37 ℃封闭 1 h；加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜3×10 min；加入二抗（1∶5 000） 37 ℃孵育1 h；TBST 洗膜 3×10 min；ECL 显影液作用于 PVDF膜上，并将膜置于凝胶成像系统中显影和拍照。Image J 软件检测各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.7 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0.2 统计软件进行绘图和统计学分析。各组SMMC-7721细胞增殖率，细胞中EdU 阳性表达率，细胞迁移率，SMMC-7721 细胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1蛋白表达水平均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’st检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组SMMC-7721 细胞增殖率和细胞中EdU阳性表达率CXCL10 培养细胞24 h 后，CCK-8 法检测结果显示：与0 mg·L－1CXCL10 组比较，10 mg·L－1CXCL10 组（112.45%±3.21%） 和30 mg·L－1CXCL10 组 细 胞 增 殖 率（125.62%±4.38%）升高（P<0.05 或P<0.01），以30 mg·L－1CXCL10 组细胞增殖率升高更明显（P<0.01）。见 图1。EdU 法 检 测 结 果 显 示：与0 mg·L－1CXCL10 组（14.91%±2.78%）比较，10 mg·L－1CXCL10 组 （26.85%±3.58%） 和30 mg·L－1CXCL10 组（36.90%±2.98%）SMMC-7721 细胞中EdU 阳性表达率明显升高（P<0.01）。见图2。

图1 各组SMMC-7721 细胞增殖率Fig.1 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups

图2 各组SMMC-7721 细胞中EdU 阳性细胞形态表现（Hoechst 33342,×100）Fig.2 Morphology of EdU positive cells in SMMC-7721 cells in various groups（Hoechst 33342,×100）

2.2 各组SMMC-7721 细胞迁移率培养48 h 后，与0 mg·L－1CXCL10 组（0.76%±0.06%） 比较，10 mg·L－1CXCL10 组 （1.90%±0.14%） 和30 mg·L－1CXCL10 （2.76%±0.12%）细胞迁移率升高（P<0.01）。见图3。

图3 各组SMMC-7721 细胞迁移形态表现（结晶紫，×200）Fig.3 Morphology of migration of SMMC-7721 cells in various groups（Crystal violet,×200）

2.3 各 组SMMC-7721 细胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表达水平处理24 h 后，与0 mg·L－1CXCL10组比较，10 mg·L－1CXCL10组和30 mg·L－1CXCL10 组SMMC-7721 细 胞 中ERK、p-ERK 及Cyclin D1 蛋白表达水平升高（P<0.01）。见图4和表1。

表1 各组SMMC-7721 细胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of ERK, p-ERK， and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups (n=3，±s）

表1 各组SMMC-7721 细胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of ERK, p-ERK， and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups (n=3，±s）

*P<0.01 vs 0 mg·L-1 CXCL10 group；△P<0.01 vs 10 mg·L-1 CXCL10 group.

Group 0 mg·L-1 CXCL10 10 mg·L-1 CXCL10 30 mg·L-1 CXCL10 Cyclin D1 0.64±0.04 1.06±0.03*1.18±0.02*△ERK 0.79±0.02 1.05±0.03*1.21±0.02*△p-ERK 0.90±0.03 1.10±0.02*1.26±0.02*△

图4 各组SMMC-7721细胞中ERK、p-ERK和Cyclin D1蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of ERK,p-ERK,and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups

2.4 ERK 抑制剂处理后各组SMMC-7721 细胞增殖率加入ERK 抑制剂PD98059 后，与0 mg·L－1CXCL10组比较，10 mg·L－1CXCL10＋PD98059组和30 mg·L－1CXCL10＋PD98059 组SMMC-7721 细胞增殖率明显降低（P<0.05），0 mg·L－1CXCL10+PD98059 组SMMC-7721 细胞增殖率差异无统计学意义（P>0.05）；与10 mg·L－1CXCL10 组比较，10 mg·L－1CXCL10＋PD98059 组SMMC-7721 细 胞增 殖率降低（P<0.05）；与30 mg·L－1CXCL10 组比 较，30 mg·L－1CXCL10+PD98059 组SMMC-7721 细胞增殖率降低（P<0.05）。见表2。

表2 ERK 抑制剂PD98059 处理后各组SMMC-7721 细胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups after treated with ERK inhibitor PD98059(n=3,±s,η/%)

表2 ERK 抑制剂PD98059 处理后各组SMMC-7721 细胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups after treated with ERK inhibitor PD98059(n=3,±s,η/%)

*P<0.01 vs 0 mg·L-1 CXCL10 group；△P<0.01 vs 10 mg·L-1 CXCL10 group；#P<0.01 vs 30 mg·L-1 CXCL10 group.

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3 讨 论

肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤难治的关键影响因素，而趋化因子与其受体结合后可通过影响血管生成、肿瘤微环境及直接影响肿瘤细胞的增殖等过程，进而影响肿瘤的恶性进程［6-7］。CXCL10 属于CXC 趋化因子家族，在多种肿瘤进程中发挥促癌作用。在乳腺癌组织中，CXCL10 能够通过蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途径促进亲代乳腺癌MCF7 细胞和他莫昔芬耐药乳腺癌MCF7 细胞的增殖［8］；在胃癌患者中，CXCL10 高表达与患者预后不良密切相关［9］；神经胶质瘤细胞中也可发现CXCL10 及其受体CXCR3 高表达，且表达水平与胶质瘤恶性程度相关［10］。在肝癌组织中，缺乏CXCL10 的小鼠能够通过减少肿瘤细胞增殖及肿瘤血管形成减缓肝癌的形成，提示CXCL10 可能是肝癌形成的关键靶点。本研究结果显示：CXCL10 能够促进体外HCC SMMC-7721 细胞的增殖。迁移能力可用来评价肿瘤的转移程度，肿瘤的转移直接影响治疗和预后。研究［11］显示：CXCL10 能够促进胰腺癌细胞向神经元迁移；CXCL10 还能够诱导乳腺癌细胞迁移［12］。本研究结果显示：CXCL10能够增强HCC SMMC-7721 细胞的迁移能力，这与TSUTSUMI 等［13］的研究结果一致。

ERK 是属于丝裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs） 家族的成员，ERK 进入细胞核后可以通过调节各种细胞转录调控因子的正常表达，影响细胞的正常生长、发育、增殖、分化、迁移和凋亡诱导等过程［14］。在肝癌［15-16］等肿瘤组织中，ERK 高表达，其能够通过促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成和诱导细胞迁移引起肿瘤恶性进程［17］。研究［18］显示：CXCL10 可以促进肝纤维化的进展，肝纤维化是形成肝癌的危险因素，而在肝癌组织中CXCL10与ERK 之间的关系尚不清楚。本研究结果显示：CXCL10 能够促进HCC SMMC-7721 细胞中ERK磷酸化，ERK 可能是CXCL10 促进HCC 细胞增殖和迁移的关键分子。 活化的ERK 可以诱导Cyclin D1 表达，抑制P27 蛋白表达，促进细胞周期从G1期向S 期过渡，从而促进细胞的增殖分裂［19］。本 研 究 结 果 显 示：CXCL10 在 激 活ERK 的磷酸化后进一步激活下游Cyclin D1 的表达，达到促进SMMC-7721 细胞增殖的作用。PD98059 是一种特异性ERK 抑制剂，可以通过抑制MEK 和ERK 的 表 达 抑 制MAPK 通 路［20］。本 研 究 结 果 显示：加入PD98059 后，CXCL10 对SMMC-7721 细胞的增殖作用明显减弱，进一步证明ERK 在CXCL10 促进SMMC-7721 细胞增殖的过程中发挥重要作用。

综上所述，CXCL10 可以通过ERK/p-ERK/Cyclin D1 通路促进HCC SMMC-7721 细胞的增殖和迁移，这为CXCL10 成为HCC 治疗靶点提供了新的依据。