红景天苷对高原红细胞增多症模型大鼠骨髓CD71+有核红细胞凋亡的影响

2023-11-11王生艳易静静

吉林大学学报（医学版） 2023年5期

郭勇, 王生艳, 易静静, 崔森

（1.青海大学研究生院，青海西宁 810000；2.青海卫生职业技术学院临床医学系，青海西宁 810000；3.青海大学附属医院血液科，青海西宁 810000）

高原红细胞增多症（high altitude polycythemia，HAPC）是长期生活在海拔2 500 m以上的人群在适应高原低氧环境失败而导致红细胞过度积累的疾病，以头晕、头痛、呼吸困难、乏力和睡眠障碍等为特征，主要表现为红细胞（red blood cells，RBC）数、血红蛋白（hemoglobin，Hb）水平和红细胞比容（hematokrit，HCT）水平升高［1-2］。HAPC 患者主要为高原移居人群，随着越来越多的人群移居高原，HAPC 发病率也逐渐升高，但其具体发病机制尚未完全阐明，目前其预防和治疗也无针对性的方法。目前国内外关于HAPC患者细胞凋亡和增殖失衡方面的相关报道仍较少，对其机制的研究也不够深入。

红景天苷是从红景天类植物中提取的主要成分，其具有广泛的药用价值，不仅在抗炎、抗毒、抗衰老、抗疲劳、抗氧化、减少自由基和抗凋亡等方面发挥重要作用，还可以治疗多种慢性疾病［3］。有研究［4］显示：红景天苷可能通过抑制HAPC 大鼠体内促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的分泌，降低HAPC 大鼠的RBC 数、Hb 水平、HCT水平和血浆黏滞度，从而改善缺氧。红景天苷还可以使HAPC 大鼠红细胞膜的流动性增强，提高红细胞的变形能力，加快血流速度，同时通过改变红细胞膜的成分来调节RBC 的功能，从而缓解HAPC 症状［5］。目前红景天苷防治HAPC 和抑制骨髓象红细胞（红系细胞）过度代偿性增生的机制尚未完全明确，而红景天苷对HAPC 骨髓红系细胞凋亡作用机制方面也暂无相关报道。

转铁蛋白CD71 在红系细胞的各个分化阶段均有表达，是确定的红系细胞的特异性标志物，常被用以标记红系细胞在体内的动态成熟过程。采用被CD71+标记过的有核RBC 可以更加直观地观察骨髓红系细胞造血功能的动态变化。本研究以HAPC模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 为材料，检测红景天苷对HAPC 模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、细胞凋亡率、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3 （cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 9 （cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）等蛋白表达水平的影响，探讨红景天苷对HAPC 患者RBC 过度积累的保护效应的机制，为红景天苷的临床应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、主要试剂和仪器本研究获青海大学附属医院伦理委员会批准（伦理批号：PSL-2022-044），遵循国际疼痛研究协会的伦理指南。45 只健康SD 雄性大鼠，6 周龄，体质量为180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京） 2021-0006，动物质量合格证号：110011210109392813。红景天苷（纯度>95%，美国麦克林试剂公司）。BCA 蛋白定量试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司），Caspase-9、Bcl-2 和Bax 及HRP-羊抗兔/小鼠二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。流式细胞仪（美国艾森生物有限公司），低温高速离心机（德国 Eppendorf 公司），Nano Drop 微量分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司），蛋白电泳仪和全自动凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 实验动物分组、模型制备和给药处理45 只SD 雄性大鼠随机分为对照组、模型组和药物组，每组15 只。对照组大鼠在实验室内以普通环境饲养，参考文献［6-7］建立HAPC 大鼠模型，实验室海拔1 500 m 药物组和模型组大鼠在低压氧舱内模拟海拔5 000 m 条件，温度为20 ℃～26 ℃，相对湿度为40%～70%，自由进食饮水，连续饲养28 d。3 组大鼠均采用灌胃给药的方式，药物组大鼠给予0.15 g·kg－1·d－1红景天苷，对照组和模型组大鼠均给予0.9%等体积NaCl 溶液，每日1 次，连续28 d。

1.3 采血和骨髓收集采用1% 戊巴比妥钠（0.04 g·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠无角膜反射和收缩反应后，经腹主动脉于EDTA 抗凝管采血2 mL，采用全自动兽血细胞仪检测大鼠血常规。记录大鼠外周血中RBC 数、Hb 水平和HCT水平，采用1×PBS 溶液冲洗大鼠双后肢股骨和胫骨中骨髓液，过滤备用。

1.4 密度梯度离心法分离各组大鼠骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）和免疫磁珠法分选骨髓CD71+有核RBC将骨髓液以1 500 r·min－1室温离心5 min 后弃去上清液，沉淀中加入2～3 mL 1×PBS 溶液混匀稀释，再加入等体积大鼠骨髓淋巴细胞分离液，以2 000 r·min－1室温离心20 min 后吸取单个核细胞，反复洗涤后离心备用。将BMMNCs 重悬于100 μL buffer 液中，加入FITCCD71 兔抗鼠单克隆抗体，4 ℃避光孵育10 min；加入5 mL buffer 液，1 500 r·min－1室温离心10 min 后弃上清；加入180 μL buffer 液和20 μL抗FITC 免疫磁珠，混匀后4 ℃避光孵育10 min；洗涤后将细胞悬液加入MS 分选柱，待液体通过分选柱后采用1 mL buffer 液冲洗后在柱中加入3 mL buffer 液，采用分选柱活塞快速将其冲入15 mL 离心管中，得到大鼠骨髓CD71+细胞。

1.5 流式细胞术检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和细胞凋亡率调整BMMNCs 浓度至1×106mL－1，取100 μL BMMNCs 置于流式管中，分别加入CD71 单克隆抗体和Annexin Ⅴ- FITC，室温下避光孵育15 min，采用流式细胞术检测20 000 个BMMNCs 中CD71+细胞数、CD71+细胞百分率和CD71+有核RBC 凋亡率。

1.6 流式细胞术检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平按照JC-1MMP 检测试剂盒配制工作液，将1×106mL－1BMMNCs 悬液加入工作液混匀，37 ℃孵育15 min 后加入1×Assay buffer，室温2 000 r·min－1、离心5 min 弃上清后上机检测。参考其他荧光设置，在MMP 水平升高时，JC-1 以聚集体的形式分布于线粒体基质中，发出红色荧光；当MMP 水平降低时，JC-1 聚集体从线粒体中释放出来，形成单体，产生绿色荧光。

1.7 流式细胞术检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Caspase-3 蛋白表达水平调整BMMNCs浓度至1×106mL－1，取100 μL 置于流式管中，加入CD71 抗体，室温下避光孵育15 min 后加入1×PBS 溶液，以1 500 r·min－1、离心5 min，共2 次，加入500 μL fixed/permeabilized 液避光 4 ℃孵育20 min；加入500 μL Perm/WashTM buffer，离心后弃上清，加入Caspase-3 抗体室温避光孵育30 min；清洗后加入500 μL Perm/WashTM buffer重悬上机检测。

1.8 Western blotting 法检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表达水平将保存于液氮中的大鼠骨髓CD71+有核RBC，采用预冷裂解液裂解，12 000 r·min－1、4 ℃离心10 min 后取上清。按照BCA 蛋白定量试剂盒方法检测吸光度（A）值，采用标准曲线公式计算样品浓度，根据不同浓度计算上样体积。30 μg 蛋白上样，80 ～130 V 电压进行电泳，200 mA 恒流转膜；1×TBST 溶液摇床清洗5 min，共3 次，5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，1×TBST 溶液清洗3 次，4 ℃一抗（1∶1 000 稀释）孵育过夜，洗膜3 次，每次10 min；室温孵育二抗（1∶10 000 稀释）1 h，洗膜3 次，每次10 min。将PVDF 膜与ECL 发光液反应2 min，采用化学发光凝胶成像系统曝光并拍照记录，采用Image J 软件分析条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/内参β-actin 条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠外周血RBC 数、Hb 水平和HCT 水平，大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率，CD71+有核RBC 凋亡率，CD71+有核RBC 中MMP 水平，CD71+有核RBC中Caspase-3、Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表达水平为计量资料，服从正态分布，以-±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血中RBC 数、Hb 水平和HCT水平与对照组比较，模型组大鼠外周血中RBC数、Hb 水平和HCT 水平均明显升高（P<0.01）；与模型组比较，药物组大鼠外周血中RBC数、Hb 水平和HCT水平均明显降低（P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠外周血中RBC 数、Hb 水平和HCT 水平Tab.1 Counts of RBC, levels of Hb and HCT in peripheral blood of rats in various groups (n=15，-±s）

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with model group.

Level of HCT（η/%）35.99±2.71 59.53±5.31*52.59±3.66△134.50<0.001 Group Control Model Drug F P Count of RBC（×1012 L－1）5.24±0.37 8.79±0.52*7.22±0.60△187.08<0.001 Level of Hb[ρB/（g·L－1）]131.93±10.19 218.33±17.49*190.73±10.73△166.98<0.001

2.2 各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和CD71+有核RBC凋亡率与对照组比较，模型组大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和CD71+有核RBC 凋亡率均升高（P<0.01）；与模型组比较，药物组大鼠骨髓CD71+ 有核RBC 百分率和CD71+有核RBC 凋亡率均降低（P<0.01）。见表2 和图1。

图1 流式细胞术检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、细胞凋亡率和CD71+ 有核RBC 中MMP 水平及Caspase-3 蛋白表达水平Fig.1 Pecentages and apoptotic rates of CD71+ nucleated RBC, levels of MMP,and expression levels of Caspase-3 protein in CD71+ nucleated RBC detected by flow cytometry

表2 各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、CD71+有核RBC 凋亡率和CD71+有核RBC 中MMP 水平及Caspase-3 蛋白表达水平Tab.2 Pecentages and apoptotic rates of CD71+ nucleated RBC, levels of MMP and expression levels of Caspase-3 protein in CD71+ nucleated erythrocytes of rats in various groups (n=6，-±s）

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

Group Apoptotic rate（η/%）MMP（η/%）Caspase-3 protein Control Model Drug F P Pecentage of nucleated RBC（η/%）15.98±3.58 27.12±2.64*22.73±1.06△28.10<0.001 32.91±1.38 50.52±2.28*3.28±2.13△△830.58<0.001 28.50±5.00 40.65±5.15*1.17±0.55△△7.46<0.001 82.01±2.78 80.32±4.44 91.24±10.95△7.39 0.20

2.3 各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平和Caspase-3 蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平差异无统计学意义（P>0.05），Caspase-3 蛋白表达水平升高（P<0.01）；与模型组比较，药物组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平升高（P<0.05），Caspase-3 蛋白表达水平降低（P<0.01）。见表2 和图1。

2.4 各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax和Caspase-9 蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bax 和Caspase-9蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，药物组大鼠骨髓CD71+有核红细胞中Bax 和Caspase-9 蛋白表达水平降低（P<0.01）。各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表3 和图2。

图2 Western blotting 法检测各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of Bcl-2，Bax，and Caspase-9 proteins in CD71+ nucleated RBC of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各组大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of Bcl-2，Bax，and Caspase-9 proteins in CD71+ nucleated RBC of rats in various groups(n=9，-±s）

*P<0.05 compared with control group；△P<0.01 compared with model group.

Caspase-9 protein 1.45±0.38 1.85±0.20*0.94±0.47△12.696<0.001 Group Control Model Drug FP Bcl-2 protein 0.93±0.37 0.92±0.36 0.53±0.27 3.27 0.06 Bax protein 0.59±0.11 1.05±0.53*0.32±0.17△10.109 0.01

3 讨论

HAPC 是一种常见的慢性高原病，会导致慢性肺源性心脏病（简称肺心病）和心力衰竭，危及患者生命，但其致病机制至今尚未完全明确。本研究结果显示：与对照组比较，模型组HAPC 大鼠的RBC 数、Hb 水平、HCT 水平和骨髓CD71+有核RBC 百分率明显升高，HAPC 大鼠CD71+有核RBC 凋亡率、CD71+有核RBC 中Caspase-3、Bax和Caspase-9 表达水平升高，MMP 水平降低，提示成功制备HAPC 模型，表明大鼠为了适应低压低氧环境，骨髓红系细胞增殖增多，从而生成更多的RBC 及Hb 以提高携氧能力，本研究结果与董旭等［8］报道结果一致。有研究［9］也同样证明了上述观点。HAPC 大鼠CD71+有核RBC 凋亡率与CD71+有核RBC 中促凋亡蛋白的表达均升高，提示骨髓RBC 凋亡升高在HAPC 中RBC 过度积累机制中具有一定作用，与RBC 增殖增强发挥协同作用，与MA 等［10］研究结果一致。廖瑜等［11］通过检测12 只低氧干预小鼠BMMNCs 中CD71+ 和Ter119+细胞凋亡率结果显示：低氧组小鼠CD71+和Ter119+细胞凋亡率高于对照组，表明在低氧条件下，骨髓RBC 凋亡的增加在HAPC 的疾病发生发展中发挥重要作用。线粒体在细胞凋亡过程中发挥重要作用，作为提供能量的场所，其参与体内的多种氧化应激反应。线粒体结构和形态会随着环境的变化而改变，故而对各种损伤较敏感，特别是低氧导致的损伤，常表现为线粒体肿胀［12-13］。当线粒体受到外界低氧刺激时，线粒体膜通透性增加，MMP 水平升高［14］。细胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）是由线粒体释放的一种促凋亡蛋白，在由线粒体介导的细胞凋亡途径中发挥重要作用。Bcl-2 家族成员形成的通道是Cyt-c 释放的主要途径。Bcl-2 家族成员主要是代表抗细胞凋亡的Bcl-2 蛋白和促细胞凋亡的Bax 蛋白。细胞质中Bax 蛋白受到凋亡刺激时会引起线粒体膜的通透性增加，释放线粒体内膜上的Cyt-c 到细胞质中，然后与同样存在于细胞质中的凋亡酶激活因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）结合，诱导并催化Caspase-9 活化，再进一步激活凋亡效应蛋白酶Caspase-3，促进细胞凋亡［15］。Bcl-2家族成员在线粒体介导的细胞凋亡途径中起双向调控的作用。Bcl-2 可以与B 细胞淋巴瘤xl（B-cell lymphoma-xl， Bcl-xl）、凋亡蛋白激活因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）及Caspase-9 结合形成复合物，使Apaf-1 构型发生改变，从而使Cyt-c 释放减少，抑制细胞凋亡［16］。Bcl-2 相关启动子（Bcl-2 asociated death promoter，Bad）可以通过去磷酸化后改变构型与Bax-Bcl-xl二聚体的Bcl-xl结合而释放出Bax，随后释放Cyt-c，进而导致细胞凋亡［17］。Bid 在JNK 信号通路作用下形成jBid，促进线粒体释放促凋亡因子（second mitochondria -derived activator of Caspases，Smac），激活Caspase-8，随后直接激活Caspase-3 诱导细胞凋亡；被激活的Caspase-8 还可以裂解Bid 形成tBid，促进线粒体释放Cyt-c，激活Caspase-9 或Caspase-3 后诱导细胞凋亡［18］。Bim 蛋白是一种BH3-only 蛋白，BH3 结构域在细胞凋亡起始过程中起关键作用，Bim 可以通过促进Cyt-c 和Smac 等的释放导致细胞凋亡［19］。

本研究结果显示：在红景天苷的作用下，HAPC 大鼠外周血中RBC 数、Hb 水平和HCT 水平及骨髓CD71+有核RBC 百分率降低，CD71+有核RBC 凋亡率、CD71+有核RBC 中Caspase-3、Bax 和Caspase-9 蛋白表达水平均降低，MMP 水平升高，提示红景天苷可能通过抑制凋亡的方式参与HAPC 的调控，并改善大鼠在低氧条件下引起的红细胞积累。研究［20-21］显示：红景天苷能够降低HAPC 大鼠的RBC 数、Hb 水平、HCT 水平和血液黏滞度，同时降低HAPC 大鼠的EPO 水平，抑制RBC 过度增生，达到改善或者预防HAPC 的作用。研究［22］显示：红景天苷可以通过抑制Bim 及其下游蛋白（Bax 及裂解的Caspase-3）表达来抑制近端肾小管细胞的凋亡；红景天苷可以通过抑制相关信号传导途径来缓解缺氧大鼠神经干细胞凋亡［23］；红景天苷可通过减少Cyt-c 释放，裂解Caspase-9 或Caspase-3 来抑制股骨头的骨细胞凋亡，诱导成骨细胞的生成［24］。邬玫竹等［25］研究显示：红景天苷能够通过降低活性氧水平，升高MMP 水平，增加Bcl-2 蛋白表达，减少Bax 和Caspase-3 蛋白表达来降低心肌细胞的凋亡水平。张常银等［26］研究显示：红景天苷能够通过降低Caspase-3 表达水平来降低不育症大鼠睾丸生精细胞的凋亡。魏玉萍等［27］研究显示：红景天苷可以通过上调Bcl-2 基因表达水平，下调Bax 基因表达水平来抑制阿糖胞苷诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡。上述研究结果均表明：红景天苷通过抑制细胞凋亡的方式发挥作用，与本研究的结果一致，红景天苷通过抑制HAPC 大鼠骨髓CD71+有核RBC 凋亡的方式，对HAPC 大鼠的发病过程起预防和保护作用。

本研究探讨了红景天苷对HAPC 模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 凋亡的影响，发现HAPC 大鼠骨髓有核RBC 凋亡增加，提示凋亡途径在HAPC的发病机制中发挥作用。红景天苷可有效抑制低氧条件下大鼠骨髓有核RBC 凋亡增加，提示红景天苷可能通过抑制凋亡的方式对HAPC 模型大鼠的发病过程起预防和保护作用。本研究为HAPC 的发病机制和临床干预提供了科学依据。