牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

朱应飞，聂 翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳

（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）

产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin ProducingEscherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（EnterogenicEscherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。牛羊等动物作为STEC 和EPEC 的宿主，可通过粪便污染肉食对人们的健康造成危害[1]。STEC 可引起溶血性尿毒症综合征，甚至可能导致死亡[2]。EPEC 可引起急性或持续性腹泻，多发于两岁以下的儿童。通常，EPEC 会引起急性水样腹泻，并伴有发烧、呕吐和脱水，该病发病迅速，在摄入细菌后几小时后出现症状[3]。本研究旨在用传统平板分离法结合分子生物学方法对江西省南昌市市售牛肉样品中的STEC 和EPEC 进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

恒温培养箱，上海智诚；实时荧光PCR 仪，伯乐；改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基，新生霉素、营养琼脂，北京陆桥；CHROMagar STEC 显色培养基，科玛嘉；改良Rainbow O157 显色培养基，Biolog；引物和探针，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 试验方法

从2018 年9 月—2019 年3 月，每月采集牛肉及制品数量为20 份，共采集7 个月合计抽取140 个牛肉及制品样本。于实验当日清晨在实验室周边超市或农贸市场购买牛肉样品，并将其置于无菌采样袋中，详细记录样品信息。采样后应置于2 ～5 ℃保存，在4 h 内检验。

1.3 样品制备和预培养

无菌操作条件下， 取样品（325±32.5）g 于BagFilter P2000 均质袋中，并向均质袋中加入（975±19.5）mL 的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1∶4的样品匀液，于（36±1）℃预培养4 h。

1.4 增菌

在生物安全柜中，向上述经过预培养的样品匀液中加入新生霉素溶液，使其终浓度为10 mg·L-1，之后于（42±1）℃培养15 ～24 h。同时以含有stx1、stx2和eae基因的大肠埃希氏菌为阳性对照，以不含stx1、stx2和eae基因的大肠埃希氏菌为阴性对照，并做培养基空白对照。阳性对照菌株可使用大肠埃希氏菌CICC10670，阴性对照菌株可使用大肠埃希氏菌ATCC25922。

1.5 实时荧光PCR 初步筛选

以16S rRNA 基因作为PCR 体系内参照，检测大肠埃希氏菌的志贺毒素编码基因stx（stx1、stx2）和紧密素编码基因eae。志贺毒素编码基因stx（stx1、stx2）、紧密素编码基因eae及内参照16S rRNA 的扩增引物和探针见引物和探针的核酸序列等同采用USDA-FSIS MLG 5C.03 中的规定[4]。

1.6 STEC 菌株的分离和确认

1.6.1 分离

用10 μL 接种环取上述增菌液划线于CHROMagar STEC显色培养基（或改良Rainbow O157显色培养基），（36±1）℃培养18 ～24 h。记录分离培养基上菌落生长情况及菌落形态，CHROMagar STEC 显色培养基上STEC 为淡紫色，其他肠杆菌为蓝色、无色或被抑制，改良Rainbow O157 显色培养基STEC 有不同颜色的菌落，蓝色、紫色、粉色或灰色。

1.6.2 生化确认

将典型或可疑菌落接种于三糖铁琼脂斜面，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种营养琼脂平板，于（36±1）℃培养18 ～24 h。大肠埃希氏菌在三糖铁琼脂斜面和底层均呈黄色，产气或不产气，H2S 实验阴性。

1.6.3 毒力基因确认

以16S rRNA 基因作为PCR 体系内参照，检测大肠埃希氏菌的志贺毒素编码基因stx和紧密素编码基因eae。实时荧光PCR 反应体系，每个样品做两个平行。分别以含有stx1、stx2和eae基因的大肠埃希氏菌的核酸提取物为阳性对照，以不含stx1、stx2和eae基因的大肠埃希氏菌核酸提取物为阴性对照，以无菌水为空白对照。引物16S rRNA（上下游）终浓度为0.16 μmol·L-1，引物stx（下上游）终浓度为1.25 μmol·L-1，引物eae（上下游）终浓度为1 μmol·L-1，探针16S rRNA 终浓度为0.1 μmol·L-1，探针stx1、探针stx2终浓度为0.25 μmol·L-1，探针eae终浓度为0.2 μmol·L-1。实时荧光PCR 反应参数为95 ℃/15 s，59 ℃/1 min，45 个循环。

2 结果与分析

2.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌总体监测情况

于2018 年9 月—2019 年3 月，每个月从超市和农贸市场抽取20 份样本，7 个月共抽取140 份牛肉及制品样本，在qPCR 初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%，2018 年9 月—2019 年3 月，每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。

2.2 携带stx 基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌和携带eae 基因的肠致病性大肠埃希氏菌检出情况

检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本为4 份，样本阳性菌株检出率为2.9%，检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本为12 份，样本阳性菌株检出率为8.6%。从9月开始监测至3月，每个月共抽取样本20 个，stx阳性检出率分别为0%、0%、10%、0%、5%、5%和0%；eae阳性检出率分别为0%、5%、10%、5%、15%、10%和15%。

2.3 阳性菌落培养特性

将PCR 结果扩增同时出现stx、eae基因阳性增菌菌悬液划线或涂布改良CHROMagar STEC 显色培养基和改良Rainbow O157 显色培养基平板上，于37 ℃培养18 ～24 h，观察形态。不同选择性琼脂平板上的菌落特征见图1。

图1 显色平板上阳性菌落

用试剂盒分离得到的阳性单菌总DNA 后，对毒力基因stx、eae进行分析，PCR 扩增结果见图2。单独携带stx的有4 株；单独携带eae基因的有9 株。

图2 分离单菌落PCR 结果

3 结论与讨论

大肠埃希氏菌是一种随着环境变化而多变的微生物，即使侵袭性感染也有可能进化出危及生命的并发症，产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）和致腹泻的大肠埃希氏菌（EPEC）菌株仍然是重要的病原体。STEC 的主要毒力因子是志贺毒素stx1和stx2（由stx1和stx2基因编码），它们干扰蛋白质合成并导致肠道细胞死亡[5]。eae基因是EPEC 引起A/E 损伤所必需的[6]。本次研究抽取的样本是140 个牛肉样品，在qPCR 初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。筛出STEC 阳性样本为4 份，样本阳性菌株检出率为2.9%，低于TORO 等[7]的研究（10%），筛出EPEC 的阳性样本为12 份，样本阳性菌株检出率为8.6%，高于LEE 等[8]的研究（4.1%）。牛肉样品中SETC 和EPEC 的检出率不容乐观，后续还将对其毒力做进一步研究，确定其致病性。