梗阻性无精子症患者不同来源精子ICSI助孕前药物疗效及安全性分析

陈其桂　李大文　成俊萍　黄泰帅

摘要：目的 探讨梗阻性无精子症（OA）患者不同来源精子行卵胞质内单精子注射（ICSI）前予左卡尼汀治疗效果、安全性及对助孕结局的影响。方法 141例OA患者口服左卡尼汀治疗3个月后，分别采用睾丸精子抽吸术（TESA）、经皮附睾精子抽吸术（PESA）获取精子，根据精子来源不同分为TESA组（78例）和PESA组（63例），均行ICSI助孕。比较2组患者的基线资料、精子质量、胚胎发育及临床结局。结果 2组OA患者予左卡尼汀治疗3个月后精子DNA断裂率（DFI）和自发顶体反应率均低于治疗前，顶体完整率高于治疗前（P＜0.05）；2组间精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率差异均无统计学意义（P＞0.05）。2组配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、优胚率、种植率、临床妊娠率、活产率、早产率、流产率及新生儿畸形率差异均无统计学意义（P＞0.05）。共获103个新鲜移植周期，989枚MII卵，受精卵子数773个，临床妊娠49例，活产分娩39例（其中TESA组17例，PESA组22例）。出生后3个月随访发现，TESA组1例新生儿患有心脏畸形，其余新生儿均无畸形。结论 OA患者行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕前予左卡尼汀治疗均可优化精子质量，改善临床结局，且用药安全。

关键词：梗阻性无精子癥；睾丸精子；附睾精子；左卡尼汀；妊娠结局

中图分类号：R699文献标志码：ADOI：10.11958/20221780

Analysis of the drug efficacy and safety before ICSI from different sources of sperm in

patients with obstructive azoospermia

CHEN Qigui LI Dawen CHENG Junping HUANG Taishuai

1 Department of Andrology， the Reproductive Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530000， China;

2 Center for Reproductive Medicine and Genetics， People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

Corresponding Author E-mail： Lidawendavid@aliyun.com

Abstract： Objective To investigate the efficacy， safety and the influence on pregnancy outcome of L-carnitine before intracytoplasmic sperm injection （ICSI） from different sources of sperm in patients with obstructive azoospermia （OA）. Methods A total of 141 patients with OA were treated with L-carnitine for three months， and sperms were obtained by testicular sperm aspiration （TESA） and percutaneous epididymal sperm aspiration （PESA） respectively. According to the source of sperm， they were divided into the two groups： the TESA group （n=78） and the PESA group （n=63）. The general clinical data， sperm quality， embryonic development and clinical outcome of the two groups were compared. Results In the TESA/PESA group， sperm DFI and sperm spontaneous acrosome reaction rate were significantly lower than those before treatment， and sperm acrosome integrity rate was significantly higher than that before treatment （P＜0.05）. There were no significant differences in sperm DFI， sperm acrosome integrity rate and sperm spontaneous acrosome reaction rate between the two groups（P＞0.05）. There were no significant differences in the fertilization rate， 2PN fertilization rate， cleavage rate， excellent embryo rate， implantation rate， clinical pregnancy rate， live birth rate， premature birth rate， abortion rate and neonatal malformation rate between the two groups （P＞0.05）. A total of 103 fresh transplant cycles， 989 MII oocytes， 773 zygotes， 49 clinical pregnancies and 39 live births were obtained （including 17 in the TESA group and 22 in the PESA group）. During a 3-month follow-up after birth， it was found that one newborn had cardiac abnormalities in the TESA group， while the other newborns had no abnormalities. Conclusion In OA patients， L-carnitine before TESA-ICSI and PESA-ICSI can improve the sperm quality， optimize clinical outcome， and the medication is safe.

Key words： obstructive azoospermia; testicular sperm; epididymal sperm; L-carnitine; pregnancy outcome

无精子症在患有不育症的育龄夫妇中约占5%，其中梗阻性无精子症（obstructive azoospermia，OA）约占40%，是男性不育的主要原因之一［1］。OA患者精液中无精子，但精子发生不受干扰。卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是辅助生殖技术中最常用的治疗方式［2］。睾丸精子抽吸术（testicular sperm aspiration，TESA）和经皮附睾精子抽吸术（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）操作简单方便，是常用的两种取精方法［3］。目前，ICSI联合睾丸或附睾精子助孕是OA患者的首选治疗方法。精子来源（睾丸精子或附睾精子）是影响ICSI结局的重要因素之一，精子质量下降对受精和胚胎发育均不利。由于OA患者受慢性生殖系统炎症影响，通过穿刺所获得的睾丸、附睾精子质量往往不高，从而影響妊娠结局。左卡尼汀可调控脂质代谢，改善细胞代谢异常，提高精子质量。但是，生殖中心临床医师常忽视在ICSI助孕前进行精子质量评估，亦未常规使用药物治疗以改善精子质量，导致ICSI助孕后受精率、妊娠率低下，临床结局不佳，甚至出现周期失败。本研究通过分析OA患者不同来源精子功能质量，评估助孕前药物干预疗效及安全性，以期为改善临床助孕结局提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月—2019年12月于广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心就诊的OA患者。OA诊断标准：（1）3次或3次以上精液常规检查，并经离心确认，精子数为零。（2）双侧睾丸体积＞30 mL或单侧体积＞15 mL。（3）血卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）正常。（4）睾丸活检证实有精子。纳入标准：（1）配偶年龄＜38岁。（2）夫妇双方染色体未见异常。（3）超排卵用药方案为长方案。（4）配偶生育力正常或单纯为输卵管、盆腔因素导致不孕。排除标准：（1）服用抑制生精药物。（2）夫妇双方生殖系统感染、生殖器发育异常等。（3）吸烟、酗酒或吸毒等。纳入符合以上条件的141对夫妇，不育年限［3（2，5）］年，男方年龄［31.00（28.50，34.00）］岁，男方体质量指数（BMI）（23.97±3.01）kg/m2，配偶年龄（29.57±3.85）岁，配偶BMI［21.00（18.88，23.03）］kg/m2。患者均予左卡尼汀口服液（东维力，东北制药，10 mL，口服，每日3次）治疗，分别采用TESA（TESA组，78例）、PESA（PESA组，63例）在左卡尼汀治疗前及治疗3个月后获取精子，由男科实验室检测精子DNA断裂率（DNA fragmentation index，DFI）、顶体完整率及自发顶体反应率，并行ICSI助孕。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵及采卵

采用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRH-a）长方案促排卵。配偶自使用促性腺激素（gonadotrophin，Gn）4 d后开始B超监测卵泡发育，当有2个卵泡直径＞18 mm时，于当日21：00左右给予人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）10 000 IU肌内注射，给药36 h后行经阴道超声穿刺取卵。

1.2.2 TESA

患者取仰卧位，常规消毒铺巾，局麻满意后，予F14号半自动活检针（苏州市立普医疗科技有限公司）抽出睾丸少量曲细精管，随后放入培养皿中，内含精子洗涤液。捣碎曲细精管组织并操作倒置显微镜找寻可用的活动精子。如果观察不到精子，可进行重复多点针刺活检。

1.2.3 PESA

患者取仰卧位，常规消毒铺巾，局麻满意后，使用含精子洗涤液的5 mL无菌注射器经皮穿刺一侧附睾，抽吸附睾液送检。若无附睾液，则改变穿刺方向反复抽吸。采用倒置显微镜找寻活动精子，如果有足量的活动精子满足ICSI治疗，操作结束；否则穿刺另一侧附睾。

1.2.4 睾丸体积测量

患者取仰卧位，选用睾丸体积测量器［弗安（上海）企业发展有限公司］，医师将测量器的不同型号与睾丸相对比确定睾丸体积，注意需将睾丸置于阴囊皮肤最薄处进行观察。

1.2.5 FSH、黄体生成素（LH）、睾酮水平检测

采用cobas e801免疫测定分析仪（罗氏诊断有限公司）进行检测。男性患者勿剧烈运动，早上空腹检查；女性患者于月经周期第3～5天早上空腹检测。

1.2.6 窦卵泡数

配偶于降调前1～2个月的月经周期第2～4天检查，排空膀胱与直肠后取截石位，采用迈瑞DC-N6彩色超声诊断仪（探头频率6.5～9.0 MHz），经阴道超声连续纵切及横切扫查完整卵巢，并记录双侧卵巢中所有直径为2～9 mm的卵泡数量，即窦卵泡数。

1.2.7 HCG日子宫内膜厚度

配偶于HCG注射日检查，排空膀胱与直肠后取截石位，采用迈瑞DC-N6彩色超声诊断仪（探头频率5.0～9.0 MHz），经阴道超声对子宫进行多切面扫查，取子宫正中矢状纵切面，在垂直于宫腔线的方向测量子宫中央两条外侧腔回声线之间的厚度，即子宫内膜厚度。

1.2.8 精子染色质扩散试验检测DFI

试剂：精子DNA完整性检测试剂盒（SCD）halosperm?（西班牙halotech公司）；瑞氏-姬姆萨染色液（珠海贝索生物技术有限公司）。操作步骤：将获得的精子置于4孔皿，密度稀释为（5～10）×10⁶个/mL，使用精子DNA完整性检测试剂盒完成变性、孵育、固定、风干步骤后，使用瑞氏-姬姆萨染色液染色，最后使用显微镜（×400），配合血球分类计数器（XK06-2，江苏新康医疗器械有限公司）进行人工判别，计数200条以上精子。按照精子染色晕圈直径与精子核直径的比值将精子晕圈分为5个等级：1，大晕圈（>1）；2，中等晕圈（1/3～1）；3，小晕圈（<1/3）；4，无晕圈；5，精子头部不着色。计算每个等级的百分比，DFI为3—5等级百分比之和。

1.2.9 精子顶体完整率及自发顶体反应率

采用豌豆凝集素（FITC-PSA）荧光染色法检测。试剂：FITC标记的PSA、磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）。操作步骤：将获得的精子置于Eppendorf管（内含PSA储存液，PBS溶解FITC标记的PSA制成），取处理后的精子涂抹于载玻片上自然干燥，将载玻片予95%乙醇固定后迅速干燥，干燥完毕后置于PSA工作液中，4 ℃避光反应8～12 h，置于450～490 nm激发光下于油镜（×400）观察涂片。判读方法：顶体区域占精子头部40%～70%，正常精子顶体在荧光显微镜下有一致且明亮的荧光，认为属于顶体完整；仅精子头部赤道板附近有明亮带状荧光者属于发生自发反应后的顶体。计数200条以上精子，统计顶体完整精子数、自发顶体发生数。顶体完整率=顶体完整精子数/检测精子总数×100%；自发顶体发生率=自发顶体发生数/检测精子总数×100%。

1.2.10 受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情况

配偶于ICSI后第1天观察卵子受精情况，以双原核（2PN）卵子作为正常受精卵。第3天按照Peter分级标准［4］选择优质胚胎进行移植，移植胚胎数≤2个，剩余Ⅲ级以上胚胎冷冻保存，并同时予黄体支持。

1.2.11 妊娠判定及随访

配偶于移植胚胎后第14天测血β-HCG水平，若阳性则确定妊娠。分别于第28、42天行B超检查胚胎发育情况，若B超见宫腔内孕囊及心管博动则确定临床妊娠。黄体支持自妊娠8周起逐渐减量至妊娠10周停用，随访至妊娠12周。电话随访记录妊娠结局。

1.2.12 计算指标

受精率=受精卵子数/第2次减数分裂中期的卵母细胞（MII卵子）数×100%；双原核（2PN）受精率=2PN卵子数/MII卵子数×100%；卵裂率=卵裂数/受精卵子数×100%；优胚率=优质胚胎数/2PN卵裂数×100%；种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期例数×100%；活产率=活产分娩数/移植周期例数×100%；早产率=临床早产例数/临床妊娠例数×100%；流产率=临床流产例数/临床妊娠例数×100%；新生儿畸形率=新生儿畸形数/出生婴儿数×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P₂₅，P₇₅）表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验，组内比较采用Wilcoxon符号秩检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ²检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TESA组与PESA组患者一般情况比较

2组患者不育年限、年龄、睾丸体积、睾酮、FSH及BMI差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。2组患者配偶的年龄、基础FSH、基础LH、窦卵泡数、HCG日子宫内膜厚度、获卵数及BMI差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 2组患者精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率比较

见表3。2组OA患者予左卡尼汀治疗3个月后精子DFI和自发顶体反应率均低于治疗前，顶体完整率高于治疗前（P＜0.05）；2组间精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率差异均无统计学意义。

2.3 2组ICSI后胚胎发育及妊娠结局比较

2组配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、优胚率、种植率、临床妊娠率、活产率、早产率、流产率及新生儿畸形率差异均无统计学意义，见表4。

2.4 ICSI周期胚胎发育及妊娠结局

共获103个新鲜移植周期，989枚MII卵，受精卵子数773个，临床妊娠49例，活产分娩39例（其中TESA组17例，PESA组22例）。出生后3个月随访发现，TESA组1例新生儿患有心脏畸形，其余新生儿均无畸形。

3 讨论

OA是由先天性双侧输精管缺如、生殖道感染或创伤性因素等引起的输精功能障碍。生殖道的任一位置均可出现梗阻，其典型特征是精子发生正常。OA病因多种，常见为泌尿生殖系统感染，可能导致单侧或双侧梗阻［5］。OA的临床治疗取决于病因，并考虑配偶因素，包括显微手术重建或取精行ICSI。在无法显微外科重建或重建失败的情况下，取精行ICSI是更可行的解决方案。

左卡尼汀，别称肉碱或肉毒碱，是生物活性的立体异构体，以一种高度极性的小两性离子的形式存在。左卡尼汀是一种有效的抗氧化剂，可减轻活性氧和自由基诱导的氧化应激的影响，且副作用非常小。人体组织分布研究表明，在成熟精子和附睾中存在高浓度的左卡尼汀，其作為转运的重要辅助因子，通过将脂肪酸和磷脂等输送到线粒体中进行β氧化供能，维持细胞能量代谢［6］；其亦可抑制睾丸内生殖细胞的凋亡，改善精子参数［7］；且其在卵母细胞成熟、精子-卵子结合和胚胎发育中具有重要作用［8］。本研究探讨了OA患者应用左卡尼汀治疗后，分别行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕的临床价值。

精子DFI是受精成功率、胚胎质量和辅助生殖结局的影响因素［9］。有研究指出，精子DFI＜30％是发动和维持妊娠的重要条件［10］。Siddhartha等［11］研究显示，精子DFI增高会导致行ICSI助孕患者的临床妊娠率降低。据研究报道，左卡尼汀可修复精子DNA损伤，从而降低精子DFI［12］。精子顶体是精子与透明带结合和穿透的重要结构，使精卵结合，受精发生，缺乏顶体的圆头精子无受精能力。Zahiri等［13］研究指出，不良精子顶体形态（如大、小或无顶体）可能会影响染色质完整性，并降低精子的生育潜力和ICSI周期妊娠率。

本研究結果显示，TESA组和PESA组OA患者予左卡尼汀治疗3个月后精子DFI和自发顶体反应率均低于治疗前，顶体完整率高于治疗前，与何泳志等［14］研究结论一致，提示OA患者ICSI助孕前应用左卡尼汀可改善睾丸及附睾精子质量。但TESA组与PESA组间精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率无明显差异，分析原因为：左卡尼汀在睾丸中具有抗凋亡作用，促进生殖相关基因表达，减轻精子损伤；左卡尼汀在附睾中可增加脂肪酸氧化，增强细胞代谢能力，改善能量供应［15］；左卡尼汀可通过不同机制对睾丸及附睾精子发挥作用，均具有明显疗效。

另外，本研究结果显示，TESA组和PESA组均获得较好的妊娠结局，分别获得17例和22例活产分娩。另外，配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、优胚率、种植率、临床妊娠率、活产率、早产率、流产率及新生儿畸形率均不受精子来源影响。由此提示左卡尼汀对睾丸及附睾精子能通过多种机制产生作用，治疗后精子质量无差异，且2组ICSI胚胎发育及临床结局无差异。这与既往多项研究［16-17］结果一致。相比以往研究，本研究观察的ICSI结局指标更全面，数据更充分，共获103个新鲜移植周期，989枚MII卵，受精卵子数773个，临床妊娠49例，活产分娩39例。本研究亦对出生后3个月新生儿畸形情况进行了随访统计，结果发现TESA组有1例新生儿患有心脏畸形，其余新生儿均无畸形。

综上所述，OA患者行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕前予左卡尼汀治疗均可优化精子质量，改善临床结局，且用药安全。临床中建议生殖医生应根据患者个人情况、取精熟练程度、生殖中心条件等灵活选用睾丸或附睾精子进行ICSI助孕。但本研究为单中心研究，且样本量较小，相关结论有待通过多中心、大样本研究进一步验证。

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（2022-11-14收稿 2023-02-08修回）

（本文編辑 陈丽洁）