应用宏基因组二代测序诊断的13例肺诺卡菌病患者的临床特征分析

杜艳 马爱平 王广东 刘群 马晓波 郭家希

诺卡菌病的发生并不常见,但在免疫功能健全和免疫抑制的患者中均可造成严重威胁生命的感染[1]。诺卡菌可引起局部到全身的播散感染,可累及肺、中枢神经系统,皮肤和其他器官[2]。近些年来,诺卡菌感染的病例报道逐渐增加[3]。因肺诺卡菌病缺乏特异的临床特征及快速准确的诊断方法,常引起诊治的延迟[4,5]。随着检验诊断技术的发展,宏基因组二代测序(metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS)作为常规临床检验外的补充应用于感染性病原体的诊断,对于疑难复杂中枢神经系统、呼吸系统以及免疫功能低下患者继发感染具有重要的临床价值[6,7]。现总结13例应用mNGS诊断为肺诺卡菌病患者的临床特征并探讨mNGS在肺诺卡菌病诊断中的应用价值。

资料与方法

一、临床资料

收集2019年1月～2021年8月厦门大学附属第一医院mNGS确诊为肺诺卡菌病的13例患者的临床资料。13例患者均具有肺诺卡菌病相关的临床症状和影像学表现,并且CT引导下经皮穿刺肺活检的组织或支气管镜下病变部位支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)、支气管刷刷头等标本经mNGS技术检测证实为诺卡菌阳性患者。本次研究通过厦门大学附属第一医院医学伦理委员会批准[(2022)科研伦审字(028)号]。

二、研究方法

1 临床资料收集

收集13例患者的临床资料,包括年龄、性别、吸烟史、基础疾病史、临床表现、并发症、胸部CT、治疗及预后情况等。

2 病原学诊断方法

13例患者中11例行支气管镜检查,其中10例进行支气管肺泡灌洗,取支气管肺泡灌洗液送检;1例进行支气管刷刷检,取支气管刷刷头送检;另外2例行经皮肺穿刺肺组织活检,取肺组织送检。所取标本送至华大基因测序仪平台(深圳华大基因股份有限公司)进行检测,经 DNA 提取、文库构建和测序,测序数据下机后去除低质量和长度小于 35 bp 的数据以获得高质量的数据。通过 BWA 软件(http//bio-bwa.sourceforge.net/)比对,将高质量数据中比对人参考基因组序列的数据与专用 4 个微生物大数据库比对,获得能够匹配到某种病原体的序列数,根据序列数的高低以及临床其他检测来判断可能的病原体。13例患者送检标本均报告检出诺卡菌。

三、统计学处理

采用SPSS 26.0进行数据统计分析,正态分布的计量资料采用均数±标准差表示,偏态分布的计量资料比较采用中位数(数据范围),计数资料采用例数(百分比)表示。

结 果

一、一般资料

本研究共13例肺诺卡菌病患者,男性5例(38.46%),女性8例(61.54%),男女比例为5 ∶8,年龄37～78岁,平均年龄(58±12)岁,体重指数(BMI)为(19.63±3.43)kg/m2,其中3例患者有长期吸烟史。13例患者中合并支气管扩张5例,陈旧性肺结核2例,肺癌1例,皮肌炎2例,多发性肌炎1例,ANCA相关性血管炎1例,类风湿性关节炎1例,纯红细胞再生障碍性贫血1例,重症肌无力、胸腺瘤1例,2型糖尿病1例,类固醇性糖尿病1例,高血压1例。6例患者有激素或免疫抑制剂使用史。其中接受糖皮质激素治疗的有1例。该例患者为重症肌无力、胸腺瘤患者,接受甲泼尼龙治疗2年,入院时服用甲泼尼龙 12 mg qd。接受免疫抑制剂治疗的有2例,1例为类风湿性关节炎患者,1例为纯红细胞再生障碍性贫血患者,2位患者均不详其具体用药方案。同时接受激素和免疫抑制剂治疗的有3例。1例皮肌炎患者接受甲泼尼龙、吗替麦考酚酯、羟氯喹治疗3月,入院时用药:甲泼尼龙 32 mg qd、吗替麦考酚酯 1g bid、羟氯喹 0.2g bid。1例多发性肌炎患者接受醋酸泼尼松、硫唑嘌呤治疗1年,入院时用药:醋酸泼尼松 25 mg qd、硫唑嘌呤 50 mg bid。1例ANCA相关性血管炎患者接受醋酸泼尼松片、托法替布、羟氯喹治疗4年,入院时用药:醋酸泼尼松 10 mg qd、托法替布 5 mg qd、羟氯喹 0.1 g tid。其中,无基础疾病患者为1名中年女性,农民,无吸烟及饮酒史,其BMI为26.01 kg/m2,为13例患者中BMI最大者(见表1)。

表1 患者的基本临床资料

二、临床症状和并发症

13例患者中表现为发热有7例,盗汗1例,咳嗽咳痰8例,干咳1例,咯血2例,胸闷3例,胸痛2例,呼吸困难7例, 头痛头晕1例,乏力2例。4例患者并发呼吸衰竭,5例并发肝功能异常,1例并发肾功能异常,8例并发电解质紊乱,1例并发消化道出血(见表2)。

表2 患者的临床表现和并发症

三、病原学检测

13例患者都进行了mNGS检测确诊,送检标本主要为肺泡灌洗液,检出的诺卡菌主要包括亚洲诺卡菌6例,盖尔森基兴诺卡菌3例,皮疽诺卡菌1例,萜烯诺卡菌1例,达松威尔拟诺卡菌1例,脓肿诺卡菌2例,南非诺卡菌1例,墨西哥诺卡菌1例(见表3)。

表3 病原学检测结果

四、影像学表现

13例患者行胸部CT检查,9例表现为双肺受累,4例患者单侧肺叶受累,患者主要表现为斑片或结节状高密度影,表现为斑片状浸润影3例,斑片状合并结节影7例,单个结节肿块影3例,空洞3例,实变、支气管充气征4例,支气管扩张5例,胸腔积液4例(大量胸腔积液2例,少量胸腔积液2例),胸膜增厚4例,纵隔淋巴结肿大5例,肺不张1例,间质性改变3例(见表4,图1)。

图1 肺诺卡菌胸部CT常见影像 A:结节肿块影;B:双肺大片实变影,内见支气管充气征;C:支气管扩张影;D:上肺空洞形成

表4 影像学表现

五、治疗

13例患者均予以磺胺甲噁唑(SMZ)治疗,3例患者单用SMZ治疗,3例患者联合亚胺培南,2例患者联合哌拉西林钠他唑巴坦钠,1例患者联合利奈唑胺,1例患者联合头孢噻肟钠,1例患者联合左氧氟沙星、利奈唑胺。2例患者发展为重症肺炎。2例重症肺炎患者均合并有皮肌炎及糖尿病。其中1例为初诊快速进展型皮肌炎,抗MDA5抗体阳性,入院时肺部CT示双肺弥漫渗出性改变,考虑皮肌炎累及肺部导致间质性肺疾病,行气管插管及体外膜肺氧合,予以SMZ联合亚胺培南、哌拉西林钠他唑巴坦钠、万古霉素治疗,该例患者病情进展,家属放弃治疗,自动出院后死亡。另1例诊断皮肌炎3月,接受甲泼尼龙、吗替麦考酚酯及羟氯喹治疗3月。3月前初诊皮肌炎时完善肺部CT提示未合并间质性肺疾病。行气管插管,予以SMZ联合莫西沙星、替加环素、利奈唑胺治疗后好转出院。患者从住院到通过mNGS确诊的中位时间为11天。13例患者中1例患者放弃治疗后死亡,余12例患者病情好转后出院。出院后随访1年,随访过程中3例患者失访,3例患者肺部CT较前无明显变化(均为支气管扩张患者),6例患者肺部CT提示病灶吸收,其中1例皮肌炎患者于随访过程中出现肺纤维化(见表5)。

讨 论

诺卡菌属于放线菌目,为革兰阳性及弱抗酸染色阳性需氧菌。诺卡菌为机会性致病菌,主要通过呼吸道吸入或者破损皮肤接触致病,常累及肺部、中枢神经系统及皮肤,易侵袭免疫缺陷患者,如淋巴瘤、恶性肿瘤、移植、长期接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗、艾滋病患者[2,8]。此外,糖尿病及酗酒也是感染诺卡菌的危险因素[8]。免疫功能正常者也可感染诺卡菌。既往研究表明多达三分之一的诺卡菌患者免疫功能正常[9]。近年来发现慢性呼吸系统疾病如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、结构性肺病等也是肺诺卡菌感染的危险因素[10]。由于激素的使用,慢阻肺患者易感染肺诺卡菌[11]。然而本研究中13例肺诺卡菌病患者均未合并慢阻肺,而有5例患者合并支气管扩张,这与杨胡琴等人研究一致[12]。本研究有1例患者无基础疾病。无基础疾病患者为1名中年女性,农民,无吸烟及饮酒史,其BMI为26.01 kg/m2,为13例患者中BMI最大者。诺卡菌为土壤腐生菌,该名无基础疾病患者感染诺卡菌可能与其长期接触土壤吸入诺卡菌相关。

肺诺卡菌病可急性、亚急性、慢性起病,以慢性多见。肺诺卡菌病临床症状不典型,主要包括发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状。肺部CT存在多种表现,如斑片影、结节影、空洞、实变影、支气管扩张、胸腔积液等。本研究肺诺卡菌病临床表现及肺部影像学表现与既往报道无明显差异[13-15]。临床上需鉴别肺诺卡菌病与其他病原菌导致的肺部感染、肺癌、肺结核、肺脓肿、肺真菌病等肺部疾病。本研究虽未发现肺外播散感染病例,但既往研究报道,在原发肺部诺卡菌感染发生播散时,62% 播散到大脑,15% 播散到多个器官,12% 播散到邻近淋巴结[16]。诺卡菌发病率虽低,但病死率较高,据报道肺部感染死亡率为41%,播散性感染死亡率为64%,颅内感染死亡率高达60%～100%[17]。值得注意的是,本研究中2例肺诺卡菌病患者病情进展为重症肺炎。2例重症肺炎患者均合并有皮肌炎及糖尿病。重症诺卡菌肺炎可危及生命,早期可无明显症状,但随着病情进展会出现呼吸衰竭、ARDS以及感染性休克,可伴不同程度的肝肾功能损害、血液系统异常以及多器官功能不全,需要进行机械通气、血液透析以及体外膜肺氧合等治疗[18,19]。早期识别及有效治疗有利于成功改善预后。

诺卡菌非人体定植菌。肺诺卡菌病的诊断主要依赖于标本(包括痰涂片、BALF、肺组织活检及脓液等)分离培养出诺卡菌[20]。目前检测诺卡菌的方法有菌体形态观察、常规培养菌落形态观察、弱抗酸染色及改良的抗酸染色、可进一步确认的MALDI-TOF飞行时间质谱以及PCR检测16S rRNA片段[21]。诺卡菌在大多数培养基上生长良好,如血平板、沙堡弱平板,但诺卡菌菌落生长缓慢,常规培养可能会漏检诺卡菌,因此单纯依靠传统病原学检测方法,容易漏诊、误诊以及延误治疗[22]。既往有研究报道肺诺卡菌病诊断的中位时间为25天[23]。mNGS通过提取临床样本库中病原体和宿主的DNA和RNA数据,直接与微生物数据库的数据进行对比,以确定样本中所含的病原微生物,对罕见致病菌诊断具有优势[24]。本研究使用mNGS的方法检出诺卡菌,不仅缩短了诊断时间,也提高了非常规病原体的诊断率,使患者能够得到及时的针对性治疗,缩短患者住院时间。本研究患者从住院到通过mNGS确诊的中位时间为11天,这与金文芳等人通过mNGS确诊肺诺卡菌病的时间相近[15]。本研究仅2例患者通过传统病原学检测方法检出诺卡菌,标本分别为痰涂片及肺活检组织涂片,可见传统病原学检测方法阳性率低。而13例患者均通过mNGS检测出诺卡菌,其中亚洲诺卡菌检出人数最多(46.16%)。本研究通过mNGS检出病原体明确诊断后,经过积极规范抗感染以及器官支持治疗,大部分患者预后良好。除1例患者因放弃治疗自动出院后死亡,余12例患者病情好转后出院,由此可进一步推断为肺诺卡菌病。不过,mNGS虽检出率高,但由于取样标本不统一,背景菌复杂,得出的信息需要临床医生结合患者病情判断是否为定植或致病菌。本研究为回顾性研究,13例患者标本未能完全用常规培养法验证,在今后研究工作中将不断完善。

确诊肺诺卡菌病后首选用药为磺胺类药物。本研究中所有患者都接受了SMZ治疗。然而有报道称诺卡菌对磺胺类药物逐渐耐药。SMZ及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMZ)耐药率可分别达到61% 和42%[25]。然而一项针对诺卡菌磺胺类药物耐药性的研究表明在552株诺卡菌中,仅14株诺卡菌对磺胺类药物耐药,其中11株对SMZ耐药,3株对TMP-SMZ耐药[26]。各研究存在较大差异可能是由于不同实验室对于药敏实验结果解读的差异以及对实验质量把控的差异[27]。因此,临床工作中仍不能忽视磺胺类药物在治疗肺诺卡菌病中的作用。此外,临床上常推荐联合用药。常用联合药物为亚胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、碳青霉烯类及头孢菌素类。其中利奈唑胺对耐药诺卡菌、诺卡菌播散感染、颅内感染、重症感染都有着较佳的疗效,不过需警惕其骨髓抑制等副作用[12,27]。此外,抗诺卡菌药物疗程要足,尤其是免疫缺陷患者及合并颅内感染患者。

总之,肺诺卡菌病由于发病率低,临床表现缺乏特异性,影像学表现多种多样,传统病原学检出率低,易漏诊、误诊而延误治疗。在治疗欠佳的社区获得性肺炎患者以及重症肺炎患者中,尤其是合并慢性呼吸系统疾病以及免疫功能缺陷时,应尽早地进行mNGS检测,提高本病病原体的阳性诊断率,给予规范、足量、足疗程的治疗,降低本病的病死率。