肺部感染中STING炎症信号通路的免疫作用机制研究

李清权 许华平 刘金环

肺部是最常受金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)影响的器官之一[1]。在S.aureus感染期间,肺泡巨噬细胞和树突状细胞被募集到感染部位并有助于细菌清除,但也可能加剧肺部炎症和损伤[2-3]。因此,这些免疫细胞和病原体之间的早期相互作用对于确定S.aureus感染疾病的结果很重要。先天免疫系统检测病原体相关分子模式通过激活模式识别受体快速响应,包括干扰素基因刺激物(stimulator of interferon genes,STING),这是宿主防御微生物感染的第一道防线[4]。STING作为感染环境中炎症的重要介质,参与调节促炎和抗炎细胞因子的分泌[5]。然而,S.aureus是否能激活STING信号通路,并通过STING介导促炎和抗炎细胞因子的分泌尚不清楚。因此,本研究分析了C57BL/6J小鼠、STING-/-小鼠在S.aureus感染期间死亡率、炎症介质产生和器官损伤的差异。

资料与方法

一、细菌菌株和动物

金黄色葡萄球菌USA 300购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将细菌菌株在Mueller-Hinton Ⅱ阳离子调节肉汤(MH肉汤,美国BD Biosciences公司)中于37 ℃培养16 h,同时不断摇晃至600 nm处的光密度为2.0。8周龄C57BL/6J WT和STING缺陷型(STING-/-)小鼠由南京大学模式动物研究所提供[6]。将小鼠安置在微型隔离笼中,并随意接受食物和水。实验室温度为(24±1) ℃。在实验之前,将小鼠安置至少2～3 d以适应环境。本研究动物实验经本院伦理委员会审批同意(伦审2021-012)。

二、小鼠的实验性感染和治疗

实验分两部分。第一部分考察STING在调节S.aureus感染诱导的小鼠死亡率中的作用。使用计算机随机化表将60只小鼠随机分为3组:对照组、C57BL/6J WT组和STING-/-组,每组20只。C57BL/6J WT组和STING-/-组小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌 (1×109CFU)。对照组小鼠腹腔注射1 mL PBS。连续观察60 h内动物存活情况。第二部分考察STING对S.aureus感染期间炎症介质产生和器官损伤的影响。使用计算机随机化表将72只小鼠随机分为3组:对照组、C57BL/6J WT组和STING-/-组,每组24只。C57BL/6J WT组和STING-/-组小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌 (1×109CFU)[7]。对照组小鼠腹腔注射1 mL PBS。分别在注射前和注射后6 h和24 h,各组随机选取8只小鼠收集血清和肺组织,用于炎症介质和器官损伤分析。

三、酶联免疫吸附试验(ELISA)

将收获的肺切成小块并称重。然后,将组织均质化并用T-PER组织蛋白提取试剂(美国Thermo Scientific公司)进行裂解,然后在4 ℃下以1500 g离心20 min。收集血清后,小鼠血清在37 ℃下孵育1 h,然后在4 ℃下孵育过夜。随后,将血清以1000 × g离心15 min,收集上清液。使用TNF-α、IL-10(美国Biolegend公司)和RANTES(美国PeproTech公司) 的ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-10和RANTES水平。

四、肺的组织病理学

从左下叶收集的肺组织样本用10%福尔马林固定,石蜡包埋,切成4 μm切片。对于组织学检查,石蜡切片用Mayer苏木精和1%伊红染色。通过光学显微镜和摄影系统观察和评估切片。将小鼠的冷冻6 μm肺组织切片在室温下解冻15 min,然后在冷丙酮中固定10 min。将解冻的切片在含有0.25% Tween的冷PBS中洗涤,并在室温下在5%牛血清白蛋白中封闭1 h。添加兔抗高迁移率组框蛋白1(high-mobility group box protein 1,HMGB1)单克隆抗体(1 ∶100,英国Abcam公司),切片在4 ℃黑暗中孵育过夜。孵育后,使用含0.25% Tween的PBS洗涤载玻3次,每次15 min,然后在Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000,英国Abcam公司)中室温避光孵育1 h。采用LSM 800共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)捕获图像(×100 放大倍率)和分析荧光强度。从每个样品中随机选择三个捕获场之一并用于荧光强度分析。在相同条件下捕获来自不同样本的图像。

五、数据分析

结 果

一、STING在调节S.aureus感染诱导的小鼠死亡率中起关键作用

采用STING缺陷型(STING-/-)小鼠研究STING在调节S.aureus感染诱导的小鼠死亡率中的作用(图1)。C57BL/6J WT小鼠腹膜内注射S.aureus后42 h的存活率为50%。STING-/-小鼠在腹腔注射S.aureus后30 h的存活率为50%(图2)。肺组织的组织病理学分析显示,S.aureus感染导致小鼠肺组织出现严重的病理变化,如肺泡破坏和肺泡腔扩张。STING-/-小鼠肺损伤程度进一步加重(图3)。

图1 WB验证STING-/-小鼠肺组织中STING敲除

图2 对数秩检验用于比较实验组之间的生存差异(n=20)。与对照组相比,*P<0.05

图3 H&E染色检测感染后24 h小鼠肺组织病理变化(×100) A:对照组;B:C57BL/6J WT组;C:STING-/-组

二、 STING参与S. aureus感染小鼠的促炎细胞因子、抗炎细胞因子和趋化因子的产生

与C57BL/6J WT组相比,STING-/-组小鼠在S.aureus感染后6 h肺和血清TNF-α、IL-10和RANTES水平均显著降低(P<0.05),而STING-/-组小鼠在S.aureus感染后24 h肺和血清TNF-α、IL-10和RANTES水平均显著升高(P<0.05)(表1-3)。

表1 ELISA分析小鼠肺和血清中TNF-α水平(感染前、感染后6 h和24 h)

表2 ELISA分析小鼠肺和血清中IL-10水平(感染前、感染后6 h和24 h)

表3 ELISA分析小鼠肺和血清中RANTES水平(感染前、感染后6 h和24 h)

三、 STING可以减弱S. aureus诱导小鼠HMGB1的表达

在S.aureus感染期间,STING-/-小鼠肺中HMGB1的表达在感染后6 h时显著低于C57BL/6J WT小鼠(P<0.05),在感染后24 h时显著高于C57BL/6J WT小鼠(P<0.05)(图4,表4)。

表4 各组感染前、感染后6 h和24 h小鼠肺组织中HMGB1的平均强度

图4 免疫荧光检测感染前、感染后6 h和24 h小鼠肺组织中HMGB1的表达(×100)。比例尺=50μm

讨 论

S.aureus是一种革兰氏阳性细菌,通常作为位于前鼻孔表面的共生细菌发现。然而,它具有多种毒力因子,在某些条件下可能会致病[8]。S.aureus引起的全身感染主要表现为菌血症、肺炎、脓毒症和中毒性休克综合征[9]。研究发现,模式识别受体识别来自S.aureus的病原体相关分子模式,然后激活NF-κB和MAPK信号通路,介导促炎细胞因子、趋化因子和抗炎细胞因子的强烈释放[10]。本研究表明,与C57BL/6J WT小鼠相比,在S.aureus感染期间,STING-/-小鼠的死亡率加快。基于这一观察,我们推断STING对于介导炎症反应和调节S.aureus诱导的小鼠死亡率可能是必不可少的,但是,STING调节这一过程的确切机制仍不清楚。为了解释观察到的现象,我们接下来探索了S.aureus感染小鼠中促炎细胞因子、趋化因子和抗炎细胞因子的水平。

先前的研究报道,在S.aureus感染小鼠的急性期,TNF-α和IL-1β水平显著升高[11]。S.aureus成分脂磷壁酸的乳房内攻击会增加各种细胞因子的mRNA表达,包括TNF-α、IL-1β和RANTES[12]。IL-10通过限制过度的炎症反应,在感染和炎症期间维持组织稳态方面发挥着重要作用[13]。细胞因子和趋化因子的产生被认为是细菌感染过程中宿主炎症反应强度的重要指标。我们的结果表明,与C57BL/6J WT小鼠在感染后6 h相比,STING-/-小鼠中TNF-α、RANTES和IL-10的产生减弱。以往的研究报道,感染早期的初始炎症反应对宿主有益,可提高细菌的清除率,是减弱细菌入侵、控制炎症和减少组织损伤的关键因素[14]。通过STING识别的S.aureus的细菌肽聚糖可以诱导IL-10的产生,从而控制组织损伤和对S.aureus感染的疾病耐受性[15]。此外,STING已被证明在S.aureus识别和清除中发挥关键作用[16]。基于先前研究的这些发现和本研究结果,我们推断在STING缺乏的情况下,宿主先天免疫系统无法全面识别来自S.aureus的病原体相关分子模式。因此,感染早期小鼠促炎细胞因子、抗炎细胞因子和趋化因子的产生受损不利于S.aureus的清除。

值得注意的是,我们的结果显示,与C57BL/6J WT小鼠相比,STING-/-小鼠在感染24 h后TNF-α、RANTES和IL-10的分泌增加。先前的研究报道,S.aureus诱导的全身炎症激活的免疫细胞会分泌大量的促炎细胞因子和抗炎细胞因子,它们负责调节免疫反应[17]。IL-10的免疫逃避作用在葡萄球菌菌血症患者中最为明显,其中IL-10水平升高与死亡率相关[18]。循环中促炎细胞因子和抗炎细胞因子水平升高会进一步增加免疫系统的活性,在极端情况下会导致器官损伤和死亡。脓毒症期间巨噬细胞内毒素耐受性的发展会重新编程STING信号传导以抑制促炎细胞因子而不抑制抗炎和抗菌介质,从而保护宿主免受过度炎症和组织损伤[19]。我们推断,在STING缺乏的情况下,宿主感染耐受性未完全激活,但免疫驱动的抗性在感染后指定时间点过度激活。这些结果在一定程度上解释了与C57BL/6J WT小鼠相比,STING-/-小鼠的死亡率在S.aureus感染期间加速。基于先前研究的这些发现和本研究结果,我们初步得出结论,STING可以在指定的时间点调节宿主感染耐受中炎症介质的产生和免疫驱动的对S.aureus感染的抵抗之间的平衡。

HMGB1被认为是与炎症反应相关的组织损伤信号[20]。与上述发现一致,本研究中与C57BL/6J WT小鼠在感染后6 h相比,HMGB1在STING-/-小鼠中的表达减弱。然而,随着S.aureus感染的延长,HMGB1的表达在STING-/-小鼠中增强。以前的研究报道,HMGB1是内毒素致死的晚期介质,并参与许多生物过程,包括脓毒症和休克[20]。在脓毒症和内毒素血症中,中和HMGB1可以阻断LPS或CLP的致死作用[21]。基于这些发现和本研究结果,我们推断在S.aureus感染期间,STING在感染耐受和免疫驱动的抵抗中发挥着关键作用,其可能通过促进HMGB1表达进而诱导炎症介质的产生,决定了小鼠器官损伤的严重程度。

综上所述,在S.aureus感染过程中,STING可以调节免疫驱动的抵抗和耐受之间的平衡,从而影响体内炎症介质的产生,进而改善肺损伤程度和死亡率。此外,在S.aureus感染期间,确保宿主先天免疫系统中STING参与对于维持宿主免疫驱动的抗性和耐受性之间的平衡至关重要。