不同廉价培养基对青贮玉米秸秆微生物的影响

■ 杨仕钰 张兰兰 燕志宏 吴光松 李 平 龚 涔 曹莉丽 邱雪松

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州煜宏生物科技有限公司，贵州贵阳 550604；3.开阳县畜禽品种改良站，贵州贵阳 550300；4.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550024）

我国是牛羊养殖大国，也是草牧业种植大国，对青贮饲料需求极高，青贮饲料主要由牧草、农业和食品加工副产物青贮发酵而成，玉米秸秆是青贮最丰富的原料之一，也是反刍动物的主要饲粮，具有营养价值高、饲喂成本低、易保存等特点[1-2]。青贮发酵主要原理是饲草表面的微生物在厌氧条件下利用饲草中可溶性碳水化合物发酵产生乳酸等有机酸，形成酸性环境[3]，从而抑制好氧性细菌、霉菌和梭菌的生长[4]。青贮添加剂能显著提升青贮品质[5]，廉价培养基的筛选对开发青贮玉米秸秆微生物作为青贮添加剂尤为重要。青贮饲料发酵是一个复杂的微生物菌落演替过程[6]，青贮微生物的组成受青贮原料、环境气候、加工工艺、厌氧程度等因素影响[7-10]。不同环境下的青贮微生物组成各不相同，保安安[11]研究结果表明青藏高原青贮微生物菌群主要由肠球菌属（Enterococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）组成；Li等[12]研究热带青贮微生物菌群表明，菌群主要为魏斯氏菌属、肠杆菌属和泛菌属（Pantoea）等；梁幸等[13]研究表明广西青贮微生物主要由乳杆菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Pphingomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）为主，后期以乳杆菌属为主；杨佳等[14]研究不同添加剂对青贮品质提升效果不同，辛亚芬等[5]研究表明青贮添加剂的组成成分不同也会对青贮品质产生影响，添加微生物菌剂能提升青贮品质[15-17]。

廉价培养基是对适用培养基进行原料替换和微量元素的控制进而达到降低培养菌群成本的低成本培养基[18]，乳酸杆菌琼脂培养基（De Man Rogosa Sharpe，MRS）作为青贮微生物常用培养基，其成本较高，难以作为青贮添加剂主要成分开发利用。在养殖过程中，养殖户常因添加剂成本较高、制作工艺复杂等因素没有持续使用，使得青贮添加剂技术难以快速推广。青贮添加剂进行开发利用的关键技术在于改良青贮菌剂组成成分和纯化微生物菌种，改良青贮菌剂组成成分有利于降低青贮添加剂的成本，改善青贮品质，助推青贮添加剂技术的高速发展。

本试验通过采集贵州青贮玉米秸秆饲料，筛选3 种常见廉价培养基，对贵州青贮微生物多样性、微生物组成、微生物生长曲线、活菌数和菌剂产量进行研究，阐述不同廉价培养基对青贮微生物的影响，筛选廉价培养基作为青贮添加剂的发酵成分，降低青贮添加剂成本，推动青贮发酵技术的高效发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

MRS固体培养基（上海博微生物科技有限公司）、MRS肉汤培养基（杭州百思生物技术有限公司）、4.6%中蛋白乳清粉（佛山西陇化工有限公司）、葡萄糖（佛山西陇化工有限公司）、玉米面（市购）、分析纯NaCl（成都金山化学试剂有限公司）、番茄（市购）。

1.2 试验设计

选用贵州优质全株玉米秸秆原料不添加微生物菌剂装入聚乙烯袋中，封口置于平均温度24 ℃室内进行厌氧发酵，青贮发酵90 d，划开聚乙烯袋后，将青贮料取出，充分混匀，随机取样并立即放入加有20%的无菌甘油EP管中，将EP管置于液氮中进行保存，再取样品100 g 与生理盐水按照1：9 稀释，加入无菌细菌冻存液，放入液氮罐保存。取部分样品送往苏州帕诺米克生物医药科技有限公司进行16S rRNA测序；带回实验室后使用MRS 固体培养基对青贮微生物进行分离纯化，按2%的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基设计4个处理，3个重复，分别为MRS肉汤培养基组、乳清粉培养基组、玉米面培养基组、番茄汁培养基组。

1.3 测定指标及试验方法

1.3.1 培养基配置

MRS 固体培养基由胰酪胨10 g、牛肉膏粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、琼脂15 g、吐温80 1 mL组成；MRS肉汤培养基由蛋白胨10 g、牛肉粉8 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.04 g、吐温80 1 mL组成；乳清粉培养基由4.6%中蛋白乳清粉50 g、葡萄糖10 g组成。玉米面培养基由玉米面与水按照1：40 的比例在60 ℃煮1 h 后用0.2 mm 过滤器过滤，过滤后加入1%葡萄糖和0.05%氯化钠制成；番茄汁培养基用市场的番茄熬煮制成番茄汁，按1：5稀释番茄汁制成。培养基配置完成后用1%盐酸将pH调至6.4，121 ℃灭菌20 min。

1.3.2 青贮微生物分离培养及鉴定

称取10 g 青贮玉米饲料加入到250 mL 含有研磨珠的锥形瓶内，加入90 mL 生理盐水，进行研磨制成悬浮液，取上清液备用；在超净工作台内用生理盐水按照1：9比例进行梯度稀释，振荡混匀，选择10-4、10-5、10-6稀释液100 μL，涂布于MRS 固体培养基，于37 ℃倒置厌氧培养48 h，培养结束后将培养皿上所有菌种刮入冻存管中保藏。

1.3.3 青贮微生物DNA提取及Illumina Miseq测序

使用Tiangen DNA kit 提取分离纯化菌株总DNA。送往苏州帕诺米克生物医药科技有限公司进行16S rDNA PCR 扩增V3～V4 区。将测序结果与Silva 数据库（Release132，http://www.arb-silva.de）进行OTU 序列比对，筛选有效序列。16S rRNA 扩增V3-V4 区引物为通用引物，序列为27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3'，1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTAC-3'。

1.3.4 发酵培养基筛选

将分离纯化的菌种按2%接种量分别接种到MRS肉汤培养基、玉米面培养基、乳清粉培养基、番茄汁培养基中进行富集培养，每2 h取一次样，使用赛多利斯pH 计测定pH，使用普析T6 紫外分光光度计在600 nm 处测定OD 值；培养48 h 取1 mL 的菌液加入99 mL的生理盐水梯度稀释，稀释至10-8、10-9、10-10三个梯度浓度，在无菌培养皿中注入1 mL 稀释菌液，将MRS 固体培养基倾注培养皿中，用量约15 mL，转动培养皿使菌液与MRS 固体培养基均匀混合；倒置于CO2培养箱中37 ℃培养72 h。采用菌落计数器进行观察，参考GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》计算活菌数。将剩余菌液在卢湘仪18M 离心机12 000 r/min 离心10 min，倒掉上清液，称取空管重和菌重，计算菌种产量。

1.5 数据统计与分析

微生物测序数据使用R 4.2.1 进行Alpha 多样性和丰度计算处理；使用SPSS 27进行数据显著性分析，分别对不同培养基微生物生长曲线、pH、活菌数、产率进行单因素方差分析，使用Origin 2018 制图。P≤0.05表示差异显著，P≤0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 青贮饲料微生物组成分析

通过对青贮饲料进行16S 测序分析，结果由图1可知，青贮饲料中微生物门水平菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）组成。贵州青贮饲料微生物属水平菌群主要由魏斯氏菌属（Weissella），丰度值为51.20%；假单胞菌属（Pseudomonas），丰度值为34.25%；片球菌属（Pediococcus），丰度值为12.75%等菌属组成。

2.2 青贮微生物Alpha多样性研究

由表1 可知，青贮饲料中微生物Simpson 指数为0.684 2，Shannon指数为7.445 5，Chao指数为1 887.197，ACE指数为1 901.210 2。

表1 青贮饲料微生物Alpha多样性指数

2.3 不同培养基对青贮微生物活菌数的影响

由图2可知，其青贮微生物活菌数依次是MRS肉汤培养基组>乳清粉培养基组>番茄汁培养基组>玉米面培养基组。结果表明，MRS肉汤培养基组活菌数极显著高于其余各组（P≤0.01），乳清粉培养基组活菌数极显著高于玉米面培养基组（P≤0.01），番茄培养基组活菌数显著高于玉米面培养基组（P≤0.05），乳清粉培养基组与番茄培养基组差异不显著（P>0.05）。MRS肉汤培养基组、乳清粉培养基组、玉米面培养基组菌泥产量差异不显著（P>0.05），玉米面培养基组菌泥产量极显著高于其他组（P≤0.01）。

图2 不同培养基的青贮微生物活菌数差异

2.4 不同培养基对青贮微生物pH、生长曲线的影响

如图3 所示，各组培养基在培养贵州青贮微生物48 h后，pH：玉米面培养基组>乳清粉培养基组>MRS肉汤培养基组>番茄汁培养基组；OD值：MRS肉汤培养基组>乳清粉培养基组>番茄汁培养基组>玉米面培养基组。如图4所示，番茄汁培养基组pH显著低于MRS肉汤培养基组、乳清粉培养基组（P≤0.05），极显著低于玉米面培养基组（P≤0.01），MRS肉汤培养基组与乳清粉培养基组差异不显著（P>0.05）；MRS肉汤培养基组的OD值显著高于乳清粉培养基组（P≤0.05），极显著高于番茄汁培养基组、玉米面培养基组（P≤0.01），乳清粉培养基组OD值极显著高于番茄汁培养基组、玉米面培养基组（P≤0.01），番茄汁培养基组OD值显著高于玉米面培养基组（P≤0.05）。

图3 不同培养基组青贮微生物pH及生长曲线变化图

图4 不同培养基组青贮微生物pH和OD值

3 讨论

近年来对地方青贮微生物作为青贮添加剂进行开发利用研究逐渐增加[19]，青贮添加剂主要有乳酸菌制剂、化学添加剂、酶制剂、营养性添加剂等[20]。其中微生物添加剂改善效果最为显著，很多的微生物青贮添加剂均已实现商品化，并且制备开发的新型添加剂也在不断涌现[21]。本研究探究廉价培养基对青贮微生物的影响，旨在挖掘低成本的青贮微生物培养基配方，结果表明，贵州青贮微生物在不同培养基中活菌数依次是MRS肉汤培养基组>乳清粉培养基组>番茄汁培养基组>玉米面培养基组，pH 为玉米面培养基组>乳清粉培养基组>MRS肉汤培养基组>番茄汁培养基组，OD浓度为MRS肉汤培养基组>乳清粉培养基组>番茄汁培养基组>玉米面培养基组；MRS肉汤培养基中营养元素全面，能提供乳酸菌繁殖生长的最佳营养条件[22]，乳清粉培养基因其含有较高蛋白质、维生素、微量元素等，常用作酵母菌发酵增菌培养基[23]，前人研究表明乳清粉培养基能提供促进乳酸菌生长的营养物质，提升发酵效果[24]，番茄培养基发酵效果优于玉米面培养基，因番茄培养基初始pH和维生素含量丰富等条件优于玉米面组[25-26]。本次研究表明MRS肉汤培养基具有高产、高品质的效果，但其成本较高，难以作为青贮添加剂培养基进行开发利用，乳清粉培养基与MRS肉汤培养基同样有着高产、高品质的特点，并且乳清粉培养基成本低，可作为玉米秸秆青贮微生物添加剂的廉价培养基。

4 结论

综上，乳清粉培养基与MRS 肉汤培养基有着高产、高品质的特点，可作为青贮玉米秸秆微生物添加剂进行开发利用的廉价培养基。