基于生物信息学和细胞实验探讨肝豆扶木汤调控铁死亡治疗肝豆状核变性的作用

郝文杰，杨文明，魏涛华，唐露露，杨 悦，钱南南，杨玉龙

（1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038； 3.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038）

肝豆状核变性，又称Wilson 病，是铜代谢障碍导致以大脑基底节变性和肝功能损害为主要表现的常染色体隐性遗传性疾病，临床上以进行性加重的肝损害、神经系统症状等为主要特征［1］。研究发现该病不仅存在铜代谢障碍，其铁代谢障碍在发病机制中也起着重要作用［2］。由于肝脏是金属离子代谢的主要靶器官，肝损害为Wilson 病患者最常见的症状，暴发性肝衰竭是最常见的致死因素［3］。进行早期干预对保护患者肝损害具有重要的临床意义。据相关研究报道，铁死亡在Wilson 病肝损害中具有起到关键作用［4］。铁死亡是一种被公认的以铁依赖性脂质过氧化为特征的细胞调控死亡形式［5］。

肝豆扶木汤是杨文明教授根据新安医学固本培元的理论，针对Wilson 病创制的专方，全方行滋补肝肾、豁痰化瘀之功。课题组前期研究发现，肝豆扶木汤能有效改善Wilson 病患者和模型鼠的肝功能及肝纤维化程度，发挥肝保护作用［6］，且其作用机制可能与调控转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1） /Smad［7］、活性氧（reactive oxygen species，ROS） /Jun 氨基末端激酶，Jun Nterminal kinase，JNK）［8］信号通路有关，但与铁死亡相关作用机制尚待深入研究。故本研究借助生物信息学系统预测肝豆扶木汤干预铁死亡的活性成分、潜在靶点，并结合体外实验进行初步验证。

1 材料

1.1 细胞株 人肝癌细胞HepG2 （货号CL-0103） 购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至70% ～80%时开始传代，用于后续实验。

1.2 药物 肝豆扶木汤由制何首乌4 g、枸杞子20 g、三七3 g、土茯苓12 g、白芍15 g、郁金12 g、柴胡12 g 组成，均购自安徽中医药大学第一附属医院，符合2020 年版《中国药典》 标准，加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后转文火再煎30 min，滤过，再加8 倍量水重复以上步骤，将2次水煎液混匀，纱布过滤后于旋转蒸发仪上浓缩至0.3 g/mL，冷冻干燥得冻干粉17.5 g，得率为22.4%，于-20 ℃冰箱中保存备用。肝豆扶木汤冻干粉溶液用无菌PBS 制成1 g/L （1 g 冻干粉相当于4.46 g 生药量） 母液，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。

1.3 试剂 DMEM 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号WH0022C021）； Erastin 试剂（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号C13632104）； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （日本TaKaRa 公司，批号AJ51485A）； CCK8 检测试剂盒、2 × SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） （武汉赛维尔生物科技有限公司，批号CR2112050、LT202201）； 山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG （上海张沈生物医药科技有限公司，批号142637、139931）； 溶质载体家族7 成员11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11） 抗体、谷胱甘肽过氧化酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 抗体、P53 抗体 （美国Affinity 公司，批号84a5792、78p5366、23y9837）； RIPA 裂解液（强）（合肥白鲨生物科技有限公司，批号69128033）；PAGE 胶促凝剂 （北京索莱宝科技有限公司，批号1020F024）； PVDF 膜 （ 美国 Millipore 公司，批号R8KA7385）； 胰酶、Western 一抗二抗去除液（上海碧云天生物技术有限公司，批号C0201、051418180626）； ECL 超敏发光试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号S1257444）； 丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20220518、20220525）； 活性氧（ROS） 检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，批号BB20081）。

1.4 仪器 3111 型恒温CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 超净工作台（上海力辰仪器科技有限公司）； CKX53 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）； 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）； 电泳仪、转膜仪（上海天能科技有限公司）； 自动曝光仪（上海培清科技有限公司）；酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

2 方法

2.1 生物信息学

2.1.1 活性成分筛选 利用BATMAN-TCM 数据库（http： / /bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/） 检索肝豆扶木汤方中何首乌、枸杞子、三七、柴胡、白芍、土茯苓、郁金7 味中药的化学成分，以靶点预测的得分值（Score cutoff） ≥20、靶点分析P＜0.05 为标准［9］，筛选出具有较高活性的成分和潜在靶点。利用 PubChem 数据库（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 下载对应的活性成分信息，以3D 结构保存为SDF 格式，用于分子对接。

2.1.2 铁死亡靶点筛选 在GeneCards （https： / /www.genecards.org/）、OMIM （http： / /www.omim.org/）、TTD数据库 （http： / /db.idrblab.net/ttd/） 中输入检索词“Ferroptosis”，收集铁死亡相关的非重复靶基因。将铁死亡相关靶点的相关度值（Relevance score） 定义为≥3，与药物活性成分作用潜在靶点进行匹配，最终获得肝豆扶木汤干预铁死亡的作用靶点，用于后续分析。

2.1.3 分子对接 选取匹配后筛选得到的核心靶蛋白作为核心受体蛋白，在PDB 数据库（https： / /www.rcsb.org）中输入靶蛋白名称，设置种属为“Homosapiens”，选取分辨率高的靶蛋白三维结构。使用CB-Docking 数据库［10］（http： / /clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php） 将筛选出来的受体与配体进行在线对接处理，比较对接后的Vina score 值，再进行对比分析。

2.2 细胞实验

2.2.1 Erastin 诱导剂最佳作用剂量和时间筛选 将HepG2细胞分为空白组、Erastin 诱导剂组，空白组只加DMEM 培养基，Erastin 诱导剂组分别加入含10、20、30、40 μmol/L Erastin 的DMEM 培养基，分别培养12、24、36、48 h 后弃培养液，每孔加入10 μL CCK8，继续培养1 h，在酶联免疫检测仪上450 nm 波长处测量各孔吸光度。

2.2.2 肝豆扶木汤冻干粉最佳作用剂量和时间筛选 将HepG2 细胞分为空白组、肝豆扶木汤冻干粉组，空白组只加DMEM 培养基，肝豆扶木汤冻干粉组分别加入含5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 冻干粉和最佳作用浓度Erastin 的DMEM 培养基，在Erastin 最佳作用时间点换液3 次后弃培养液，每孔加10 μL CCK8，继续培养1 h，在酶联免疫检测仪上450 nm 波长处测量各孔吸光度。

2.2.3 分组及给药 实验分为空白组 （HepG2 细胞＋PBS）、模型组（HepG2 细胞＋Erastin 诱导剂） 和肝豆扶木汤低、中、高剂量组（HepG2 细胞＋Erastin 诱导剂＋160、320、640 μg/mL 肝豆扶木汤冻干粉）。取对数生长期HepG2 细胞，接种于平底培养板，每组设3 个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，模型组加入最佳浓度的Erastin 诱导剂，肝豆扶木汤组同时加入最佳浓度的Erastin 诱导剂和不同质量浓度的冻干粉，空白组加入等量PBS 溶液，处理至Erastin 诱导剂最佳时间点时进行换液，继续处理至冻干粉最佳作用时间后检测相关指标。

2.2.4 GSH、MDA 水平检测 取对数生长期HepG2 细胞，接种于6 孔板，按“2.2.3” 项下方法处理，按照相关试剂盒说明书操作步骤检测GSH、MDA 水平。

2.2.5 ROS 水平检测 取对数生长期HepG2 细胞，接种于6 孔板，按“2.2.3” 项下方法处理，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min，其间颠倒混匀4 ～5 次，使细胞与探针充分接触，再用无血清培养基洗涤细胞3 次，除去多余的DCFH-DA，于倒置荧光显微镜下观察荧光强度，NovoExpress 软件分析并计算荧光强度值。

2.2.6 Western blot 法检测细胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表达 按“2.2.3” 项下方法处理细胞，提取各组细胞总蛋白，经电泳、转膜、封闭后，分别加P53 （1 ∶500）、SLC7A11 （1 ∶500）、GPX4 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶500）一抗，4 ℃孵育过夜，加相应二抗继续孵育2 h，显影，用Image J 软件分析条带灰度值。

2.2.7 RT-qPCR 法检测细胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA表达 按“2.2.3” 项下方法处理细胞，提取RNA，逆转录为cDNA，然后进行PCR 扩增，2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，若满足正态性和方差齐性，2 组间比较采用独立样本t检验，组间多重比较采用LSD 法； 反之，采用Kruskal-Wallis 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 生物信息学

3.1.1 活性成分及作用靶点 以Score cutoff≥20、P＜0.05为条件进行检索，得到肝豆扶木汤方中化学成分226 种，其中何首乌16 种，枸杞子46 种，白芍18 种，三七51 种，土茯苓13 种，柴胡63 种，郁金18 种。以OB ≥30%、DL≥0.18 为条件，筛选得到214 种化学成分。

3.1.2 作用靶点筛选 共得到肝豆扶木汤活性成分潜在作用靶点10 463 个，其中何首乌298 个，枸杞子2 077 个，白芍300 个，三七3 964 个，土茯苓367 个，柴胡1 845个，郁金1 612 个，剔除重复部分，得到潜在作用靶点1 741个。利用GeneCards 数据库获得274 个与铁死亡相关的靶基因，相关度值（Relevance score） 定义为≥3，最终获得与铁死亡相关的靶基因23 个。将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，最终收集11 个共同作用靶点用于分子对接分析，见图1。

图1 肝豆扶木汤活性成分靶点与铁死亡靶点的韦恩图

3.1.3 分子对接 将11 个铁死亡核心靶蛋白与对应的肝豆扶木汤活性成分进行分子对接，并根据Vina score 值绘制热图（图2），其中Vina score＜-7.0，表明靶蛋白与活性成分结合性好，而且Vina score 值越小，两者结合能力越强［11］。由此可知，肝豆扶木汤的主要活性成分维生素B2、抗坏血酸、γ-氨基丁酸、尼克酸、维生素C、核黄素、芍药二酮、鬼伞毒素、苯乙酮、3，4-二甲基苯甲酸、邻苯二酸辛酯、白芷素、壬烯酸、亚麻酸、姜黄酮、莪术二酮、姜黄烯、香芹酮与铁死亡核心靶点SLC7A11 蛋白均有很强的结合能力，再绘制对接模式图（图3）。此外，维生素B2、核黄素、芍药二酮、白芷素、莪术二酮与TP53、ACSL4、ACSL4、VDAC2、VDAC3、ALOX15、PRKAA1、MDM2 靶蛋白均有良好的结合能力。

图2 肝豆扶木汤活性成分与铁死亡核心靶蛋白分子对接热图

图3 肝豆扶木汤活性成分与SLC7A11 蛋白对接模式图

3.2 细胞实验

3.2.1 Erastin 诱导剂最佳作用剂量、时间筛选 与空白组比较，10 μmol/L Erastin 诱导剂作用12、24、36、48 h 时细胞活性均高于50%，20 μmol/L Erastin 诱导剂作用12、24 h时细胞活性均高于50%，30 μmol/L Erastin 诱导剂作用36、48 h 时细胞活性均低于50%，40 μmol/L Erastin 诱导剂作用12、24、36、48 h 时细胞活性均低于50%，故选择30 μmol/L、24 h 分别作为Erastin 诱导剂最佳作用剂量、时间，见表2。

表2 Erastin 诱导剂不同作用剂量、时间下细胞相对活性（±s，n＝3）

表2 Erastin 诱导剂不同作用剂量、时间下细胞相对活性（±s，n＝3）

注： 与空白组比较，*P＜0.05。

组别剂量/（μmol·L-1）12 h24 h36 h48 h空白组01.002±0.0111.003±0.0221.014±0.0161.001±0.021 Erastin 诱导剂组100.879±0.041*0.825±0.029*0.783±0.027*0.692±0.063*200.688±0.017*0.649±0.044*0.509±0.040*0.469±0.014*300.557±0.060*0.496±0.029*0.282±0.011*0.249±0.018*400.287±0.044*0.214±0.021*0.176±0.014*0.146±0.012*

3.2.2 肝豆扶木汤冻干粉最佳作用剂量、时间筛选 与空白组比较，5 μg/mL 冻干粉作用48、72 h 时，10、20、40、80 μg/mL 冻干粉作用24、48 h 时，以及160 μg/mL 冻干粉作用24 h 时细胞活性降低（P＜0.05）； 40、80、160 μg/mL冻干粉作用72 h 时，320 μg/mL 冻干粉作用48、72 h 时，以及640 μg/mL 冻干粉作用24、48、72 h 时细胞活性升高（P＜0.05），故选择160、320、640 μg/mL 分别作为低、中、高剂量，见表3。

表3 肝豆扶木汤冻干粉不同作用剂量、时间下细胞相对活性（±s，n＝3）

表3 肝豆扶木汤冻干粉不同作用剂量、时间下细胞相对活性（±s，n＝3）

注： 与空白组比较，*P＜0.05。

组别剂量/（μg·mL-1）24 h48 h72 h空白组01.003±0.0221.001±0.0210.999±0.013肝豆扶木汤冻干粉组50.984±0.0140.824±0.033*0.914±0.072*100.935±0.010*0.846±0.068*0.991±0.048 200.867±0.013*0.853±0.078*1.037±0.049 400.822±0.008*0.917±0.034*1.084±0.061*800.787±0.018*0.950±0.066*1.129±0.042*1600.920±0.014*1.075±0.0341.174±0.01*3201.051±0.0221.286±0.027*1.305±0.009*6401.170±0.061*1.330±0.068*1.364±0.029*

3.2.3 肝豆扶木汤对Erastin 诱导HepG2 细胞GSH、MDA、ROS 水平的影响 与空白组比较，模型组细胞GSH 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01），ROS 荧光强度增强（P＜0.01）； 与模型组比较，肝豆扶木汤各剂量组细胞GSH 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），ROS 荧光强度减弱（P＜0.01），并呈剂量依赖性，见图4。结果表明，肝豆扶木汤能提高HepG2 细胞GSH 水平，降低MDA、ROS 水平，提高抗氧化能力，抑制HepG2 细胞的氧化应激损伤。

图4 肝豆扶木汤对HepG2 细胞GSH、MDA、ROS 水平的影响（±s，n＝3）

3.2.4 肝豆扶木汤对Erastin 诱导HepG2 细胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组细胞P53 蛋白表达升高（P＜0.01），SLC7A11 和GPX4 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，肝豆扶木汤中、高剂量组细胞P53 蛋白表达降低（P＜0.01），肝豆扶木汤各剂量组细胞SLC7A11、GPX4 蛋白表达升高（P＜0.01），并呈剂量依赖性，见图5。结果表明，肝豆扶木汤抑制HepG2细胞铁死亡的作用可能与其下调P53 蛋白表达，上调SLC7A11、GPX4 蛋白表达有关。

图5 肝豆扶木汤对HepG2 细胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.2.5 肝豆扶木汤对Erastin 诱导HepG2 细胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表达的影响 与空白组比较，模型组细胞P53 mRNA 表达升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，肝豆扶木汤各剂量组细胞P53 mRNA 表达降低（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表达升高（P＜0.01），并呈剂量依赖性，见图6。结果表明，肝豆扶木汤抑制HepG2 细胞铁死亡的作用与其下调P53 mRNA 表达，上调SLC7A11、GPX4 mRNA 表达有关。

图6 肝豆扶木汤对HepG2 细胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表达的影响（±s，n＝3）

4 讨论

肝损害几乎是每一个Wilson 病患者都存在的症状，如不能及时有效地进行干预，易出现暴发性肝衰竭，甚至导致死亡［3］。如能早期有效干预，则能显著延缓肝损害的病理进程［12］。近年来，国内外学者对Wilson 病肝损害的分子机制研究取得了一定的进展［13-14］。Wilson 病患者存在铁代谢障碍，铁离子的沉积在疾病的进展中起到重要作用［15-16］。分子对接技术是通过计算机模拟化合物与蛋白质受体匹配的模式和亲和力，是现代药物探索和新药发现的重要工具［17］。故本研究将肝豆扶木汤的活性成分与铁死亡相关蛋白进行分子对接，结果显示铁死亡关键蛋白SLC7A11 与肝豆扶木汤的活性成分具有良好的结合能力。

肝豆扶木汤是针对Wilson 病肝损害的病机特点创立而成［18］，由枸杞子、白芍、制何首乌、三七粉、土茯苓、柴胡、郁金组成，课题组前期临床和基础实验研究证实该方对Wilson 病肝损害具有保护作用［19］。现代药理表明，肝豆扶木汤的活性成分具有抗氧化等作用［20-21］。本研究采用Erastin 诱导HepG2 细胞构建铁死亡模型，以肝豆扶木汤干预，发现肝豆扶木汤能提高HepG2 细胞的抗氧化能力，对细胞具有保护作用。细胞内ROS、MDA 升高及GSH 消耗是氧化应激的标志，也是铁死亡发生的标志之一。本研究结果显示，HepG2 细胞经Erastin 诱导后，其ROS 和MDA 水平升高，GSH 水平降低，说明Erastin 诱导HepG2 细胞发生氧化应激； 而肝豆扶木汤干预降低了ROS 和MDA 水平，提高了GSH 水平，说明肝豆扶木汤具有抗氧化的作用。

SLC7A11 可促进细胞对胱氨酸的摄取和GSH 合成，提高抗氧化能力，保护细胞免受铁死亡［22］。P53 可以抑制SLC7A11 表达，导致GSH 合成受损并增加消耗，促进铁死亡［23］。GPX4 是一种抗氧化酶，能降低ROS 水平来抑制铁死亡的发生，而GSH 缺失可使GPX4 失活［24］。抑制GPX4活性可导致脂质过氧化物积累发生铁死亡［25］。当SLC7A11表达被抑制，胱氨酸吸收减少，GSH 合成被影响，导致GPX 活性降低，抗氧化能力下降，ROS 积聚，最终导致铁死亡［26］。本研究采用Erastin 诱导处理HepG2 细胞后，其P53 蛋白和mRNA 表达升高，SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表达降低，说明Erastin 处理后的HepG2 细胞发生了铁死亡； 而肝豆扶木汤干预后下调了P53 蛋白和mRNA 表达，上调了SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表达，说明肝豆扶木汤能够抑制铁死亡，且可能通过SLC7A11/GPX4 轴对细胞产生保护作用。

综上所述，肝豆扶木汤能通过降低ROS 和MDA 水平，提高GSH 水平，下调P53 表达，上调SLC7A11 和GPX4 表达来减轻HepG2 细胞的铁死亡，其作用可能是通过调控SLC7A11/GPX4 轴实现的。本研究为临床运用肝豆扶木汤治疗Wilson 病患者肝损害提供科学证据。