倒心盾翅藤抗炎活性部位对马兜铃酸肾病大鼠肾脏的保护作用

王婉丽，樊 馨，杨亚彬，李婷婷*

（1.西双版纳职业技术学院，云南 景洪 666100； 2.西双版纳傣族自治州人民医院，云南 景洪 666100）

马兜铃酸主要存在于马兜铃科的植物中，常见于关木通、广防己等药材，具有抗感染、抗肿瘤、增强细胞免疫等功能［1-2］。服用含马兜铃酸的中草药或中成药制剂会引起不同程度肾损害，被称为马兜铃酸肾病［3-4］。马兜铃酸肾病是一种快速进展的间质性肾炎，不仅多种炎症细胞在肾脏浸润、聚集和活化，参与肾小管的损伤过程，同时伴有多种炎症因子水平上调［5-6］。因此，控制过度的炎症反应是对抗马兜铃酸肾毒性的重要途径。

倒心盾翅藤为傣族常用“解药”，系金虎尾科植物倒心盾翅藤AspidopterysobcordataHemsl.var.obcordata的干燥藤茎，收载于2005 年版《云南省中药材标准—傣族药》，用于治疗急慢性肾炎，疗效确切［7-8］。作为傣医临床用量最大的药材，倒心盾翅藤受到越来越多的关注，其化学成分和抗结石、抗肿瘤等生物活性的研究均取得了一定的进展［9-10］。但是倒心盾翅藤抗炎的活性成分和治疗肾炎的作用尚未完全明确。本研究建立脂多糖 （LPS） 刺激RAW264.7 细胞炎症反应模型，对倒心盾翅藤抗炎活性成分进行筛选，并评价其对马兜铃酸肾病过程中炎症反应的干预作用及机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SPF 级SD 大鼠，体质量220 ～240 g，购自斯贝福（北京） 生物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2019-0010］，饲养于中国医学科学院药用植物研究所云南分所SPF 动物房，温度22～28 ℃，相对湿度40% ～60%，12 h/12 h 明暗交替，自由摄食饮水，经隔离观察、适应环境5 d 后用于实验。动物实验经云南分所实验动物伦理委员会批准（伦理号20190013）。

1.2 细胞 RAW264.7 细胞（货号CM0190），购自武汉普诺赛生命科技有限公司，使用含有10% 胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基进行培养，培养条件为37 ℃、5%C O2［11］。每2 d 更换培养基，细胞融合度达到80%以上时进行传代。

1.3 试剂与药物 DMEM 高糖培养基、PBS （美国HyClone 公司，批号AD2496722、AE29431651）； 胰酶（美国Gibco 公司，批号2085646）； 胎牛血清（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号1919401）； LPS （美国Sigma 公司，批号L2880）； CCK-8 试剂、NO 检测试剂盒、弗氏完全佐剂（上海碧云天生物技术有限公司，批号C0043、S0021S、P2036）； 蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、电发光试剂盒、制胶试剂盒、电泳液、转膜液、TBST、二抗goat anti-mouse、goat anti-rabbit （江苏康为世纪生物科技股份有限公司，批号01364、30333、20405、60447、50439、01438、50451、40427、20426）； 大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 检测试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号KMC0061、BMS6002、BMS607-3）； 脱脂奶粉（美国BD公司，批号4239539）； p-p38、p-p65、β-actin 抗体（美国OriGene 公司，货号RC206605、TA325803、TA81100S）；硝酸纤维素膜（德国Millipore 公司）； 多聚甲醛（合肥白鲨生物科技有限公司，批号BL539A）。醋酸泼尼松片（津药药业股份有限公司，批号181019）。倒心盾翅藤、关木通均由西双版纳傣族自治州人民医院提供，经西双版纳傣族自治州人民医院李婷婷副研究员分别鉴定为金虎尾科植物倒心盾翅藤AspidopterysobcordataHemsl.var.obcordata、马兜铃科植物木通马兜铃AristolochiamanshuriensisKom.。

1.4 仪器 SW-CJ-1F 超净工作台（江苏苏净集团有限公司）； CKX41 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）； Spectra Max i3 酶标仪（美国Molecular 公司）； DV 215CD 十万分之一天平（美国OHAUS 公司）； 5200 Multi 全自动荧光图像分析系统、EPS300 电源（天能集团）； 脱水机、包埋机、切片机、染色剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 倒心盾翅藤不同部位提取物和关木通水提物的制备 倒心盾翅藤饮片粉碎后，加6 倍量50%乙醇回流提取，减压浓缩至稠膏，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，减压干燥获得不同极性提取物，准确称取适量，加二甲基亚砜超声溶解，调整质量浓度为20 mg/mL。关木通饮片加8 倍量水回流提取2 次，每次2 h，合并药液，减压浓缩至生药量为2 g/mL。

2.2 RAW264.7 细胞毒性检测 收集对数生长期RAW264.7 细胞，计数并调整密度为5.0×104/mL，每孔200 μL，接种到96 孔板中，待细胞贴壁后加入倒心盾翅藤不同部位提取物，质量浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg/mL，空白孔加入含1% 二甲基亚砜 （DMSO） 的DMEM 培养基，LPS 对照孔加入含1 μg/mL LPS 的DMEM培养基，各组均设置3 个复孔，孵育24 h 后，弃去含药培养基，每孔加入DMEM 培养基100 μL、CCK-8 试剂10 μL，继续培养4 h，于酶标仪450 nm 波长处检测吸光度（A），计算细胞存活率。

2.3 RAW264.7 细胞NO 水平检测 收集对数生长期RAW264.7 细胞，计数并调整密度为5.0×104/mL，每孔200 μL，接种到24 孔板中，培养24 h 后加药进行刺激。给药组细胞加入不同质量浓度倒心盾翅藤提取物（以不影响RAW264.7 细胞增殖为宜），空白组、LPS 组加入DMEM 培养基，各组设置3 个复孔，孵育6 h 后弃去培养基。除空白组外各孔加入含1 μg/mL LPS 的DMEM 培养基，孵育24 h，每孔取细胞培养液50 μL 于96 孔板中，加入Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ各50 μL，于540 nm 波长处检测A，以亚硝酸钠为对照绘制标准曲线，计算NO 水平。

2.4 动物分组、给药及取材 大鼠随机分为空白组、模型组、阳性组和倒心盾翅藤高、中、低剂量组，每组10 只。除空白组外，其余各组大鼠每天灌胃关木通水提液（60 g/kg），连续5 d［12］，第6 天将大鼠置于代谢笼中收集24 h 尿液，次日各组分别给药。倒心盾翅藤低、中、高剂量组分别灌胃给予15、30、60 g/kg 倒心盾翅藤二氯甲烷部位的羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 混悬液，阳性组灌胃给予2.7 mg/kg 醋酸泼尼松，空白组、模型组灌胃给予等量CMCNa，连续7 d，末次给药后再次收集24 h 尿液。大鼠麻醉后腹主动脉取血，全血静置30 min，3 500 r/min 离心15 min，取上层血清于-20 ℃冰箱中保存待测； 处死大鼠，取双肾，左肾于4%多聚甲醛中固定，右肾经液氮冷冻后于-80 ℃冰箱中保存待测。

2.5 大鼠24 h 尿蛋白量、血清IL-1β、TNF-α、IL-6 水平检测及肾组织HE 染色 BCA 法检测大鼠尿液蛋白浓度后，根据尿液体积计算24 h 尿蛋白量。按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6 水平。大鼠肾组织经多聚甲醛固定72 h，按常规程序脱水后包埋于石蜡中，连续失状切片后进行HE 染色。每个切片随机选取3 个视野，观察肾脏损伤情况，并参考文献［13］ 报道方法进行0 ～4半定量评分，标准为0 分，未发生病变； 1 分，病变部分≤20%； 2 分，病变部分20% ～40%； 3 分，病变部分40% ～80%； 4 分，病变部分≥80%。

2.6 Western blot 法检测大鼠肾组织p38 MAPK/NF-κB p65信号通路蛋白表达 提取大鼠肾组织蛋白，BCA 法定量后稀释至同一浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜，根据Marker 剪取目标条带，经脱脂奶粉溶液封闭后，一抗4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次后二抗室温孵育2 h，TBST 清洗，ECL 试剂孵育3 min，凝胶成像系统显影，使用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以内参β-actin 灰度值进行归一化处理，计算p-p38、p-p65 蛋白表达。

2.7 统计学分析 通过Graphpad Prism 6.01 软件进行处理，服从正态分布、方差齐性的数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，病理切片评分采用秩和检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 倒心盾翅藤对RAW264.7 细胞增殖的影响 如表1 所示，与空白组比较，100、200 μg/mL 倒心盾翅藤石油醚部位，200 μg/mL 二氯甲烷部位，25 ～200 μg/mL 正丁醇部位，100、200 μg/mL 水提部位组细胞存活率降低（P＜0.05，P＜0.01），故将未明显影响RAW264.7 细胞生长的质量浓度用于后续实验。

表1 倒心盾翅藤对RAW264.7 细胞增殖的影响（±s，n＝3）

注： 与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别质量浓度/（μg·mL-1） 细胞存活率/%空白组—100.00±0.00倒心盾翅藤石油醚部位组12.5101.27±4.56 25104.51±5.61 50101.80±4.31 10079.41±4.79**20052.62±4.64**倒心盾翅藤二氯甲烷部位组12.5103.44±3.54 25103.23±4.18 50102.27±3.55 100104.33±4.02 20084.48±6.20**倒心盾翅藤乙酸乙酯部位组12.5102.50±2.46 25102.41±4.01 50102.97±3.76 100100.54±5.01 200103.51±5.76倒心盾翅藤正丁醇部位组12.5102.74±3.54 2593.04±2.05*5077.99±5.28**10023.58±1.84**20027.91±2.38**倒心盾翅藤水部位组12.5101.12±2.57 25103.91±5.78 50101.88±4.47 10073.04±4.28**20056.37±5.49**

3.2 倒心盾翅藤二氯甲烷部位对LPS 诱导RAW264.7 细胞释放NO 的影响 如表2 所示，RAW264.7 细胞在正常状态下，释放NO 水平较低。与空白组比较，LPS 组RAW264.7细胞NO 水平升高（P＜0.01），表明细胞炎症反应模型建立成功； 与LPS 组比较，25、50、100 μg/mL 倒心盾翅藤二氯甲烷部位组NO 释放量降低（P＜0.05，P＜0.01），表明它可在该浓度范围内剂量依赖性地抑制LPS 诱导的NO释放。

表2 倒心盾翅藤对LPS 诱导RAW264.7 细胞NO 水平的影响（±s，n＝3）

表2 倒心盾翅藤对LPS 诱导RAW264.7 细胞NO 水平的影响（±s，n＝3）

注： 与空白组比较，＃＃P＜0.01； 与LPS 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别质量浓度/（μg·mL-1） NO/（μmol·L-1）空白组—7.28±2.27 LPS 组—71.50±5.27＃＃倒心盾翅藤石油醚部位组12.572.56±5.27 2566.77±5.26 5063.11±2.57倒心盾翅藤二氯甲烷部位组12.561.75±6.40 2555.25±5.45*5039.52±5.24**10023.89±3.49**倒心盾翅藤乙酸乙酯部位组12.569.25±3.28 2567.84±2.79 5070.84±2.47 10074.88±5.70 20064.35±3.12倒心盾翅藤正丁醇部位组12.567.13±6.79倒心盾翅藤水部位组12.566.15±3.60 2572.40±6.52 5069.21±3.55

3.3 倒心盾翅藤二氯甲烷部位对马兜铃酸肾病大鼠24 h尿蛋白量、血清炎症因子水平的影响 如表3 所示，与空白组比较，模型组大鼠24 h 尿蛋白量和血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，倒心盾翅藤二氯甲烷部位各剂量组和阳性组24 h 尿蛋白量、血清炎症因子水平降低（P＜0.01），提示倒心盾翅藤二氯甲烷部位可减轻马兜铃酸引起的肾脏损伤。

表3 各组大鼠24 h 尿蛋白量、血清炎症因子水平比较（±s，n＝10）

表3 各组大鼠24 h 尿蛋白量、血清炎症因子水平比较（±s，n＝10）

注： 与空白组比较，＃＃P＜0.01； 与模型组比较，**P＜0.01。

组别24 h 尿蛋白量/mgIL-1β/（μg·L-1）IL-6/（μg·L-1）TNF-α/（μg·L-1）空白组0.98±0.2321.25±4.0871.60±11.5822.45±3.08模型组5.60±1.31＃＃91.61±9.57＃＃259.91±16.01＃＃119.89±9.24＃＃阳性组2.56±1.00**45.24±7.56**111.94±13.15**37.98±6.07**倒心盾翅藤高剂量组2.64±0.68**44.59±4.76**151.71±16.12**42.83±5.70**倒心盾翅藤中剂量组3.29±0.86**48.16±6.13**167.50±19.11**66.08±6.14**倒心盾翅藤低剂量组3.39±0.71**68.09±4.75**205.64±15.40**89.38±5.96**

3.4 倒心盾翅藤二氯甲烷部位对马兜铃酸肾病大鼠肾组织病理形态的影响 如图1、表4 所示，空白组大鼠肾组织无炎性细胞浸润、肾小管上皮结构完整，间质血管无充血、扩张，未见组织纤维化等病理改变； 模型组可见肾小管上皮细胞刷毛缘脱落、管腔扩张、水变性、空泡变性、完全坏死，部分肾小球发生萎缩，球囊腔上皮脱落，肾间质存在充血、出血、炎细胞浸润的现象，病理评分高于空白组（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性组、倒心盾翅藤各剂量组大鼠肾小管损伤、变性，肾小球萎缩、间质充血、炎细胞浸润等病理改变有不同程度的减轻，病理评分低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠肾组织HE 染色（×200）

表4 各组大鼠肾组织病理评分比较（±s，n＝10）

表4 各组大鼠肾组织病理评分比较（±s，n＝10）

注： 与空白组比较，＃＃P ＜0.01； 与模型组比较，*P ＜0.05，**P＜0.01。

组别病理评分/分空白组1.00±0.00模型组3.73±0.45＃＃阳性组2.17±0.46**倒心盾翅藤高剂量组2.13±0.51**倒心盾翅藤中剂量组2.73±0.52*倒心盾翅藤低剂量组2.73±0.69*

3.5 倒心盾翅藤二氯甲烷部位对马兜铃酸肾病大鼠肾组织p38 MAPK/NF-κB p65 信号通路蛋白表达的影响 如图2、表5 所示，与空白组比较，模型组大鼠肾组织p-p38、p-p65蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，倒心盾翅藤二氯甲烷部位各剂量组p-p38、p-p65 蛋白表达降低 （P＜0.01），提示倒心盾翅藤抗炎作用与抑制p38 MAPK/NF-κBp65 信号通路活化、炎症因子产生有关。

图2 各组大鼠肾组织p-p38、p-p65 蛋白条带

表5 各组大鼠肾组织p-p38、p-p65 蛋白表达比较（±s，n＝3）

表5 各组大鼠肾组织p-p38、p-p65 蛋白表达比较（±s，n＝3）

注： 与空白组比较，＃＃P＜0.01； 与模型组比较，**P＜0.01。

组别p-p38/β-actinp-p65/β-actin空白组2.55±0.1531.88±1.79模型组55.68±2.03＃＃42.04±2.71＃＃阳性组11.03±0.46**12.99±1.44**倒心盾翅藤高剂量组14.08±0.92**10.61±1.38**倒心盾翅藤中剂量组20.02±1.88**18.49±1.99**倒心盾翅藤低剂量组23.60±1.88**19.64±2.23**

4 讨论

马兜铃酸肾病是由马兜铃酸引起的肾损伤，主要损伤部位在肾小管，根据病程进展和病变程度可以分为急性型、慢性型和肾小管功能障碍型［14］。在多种急性型马兜铃肾病的动物模型中，有多个炎症信号转导通路被激活，说明炎症参与了马兜铃酸损伤肾脏过程［15-17］。本研究利用LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 建立了体外炎症模型［18］。在活化的RAW264.7 细胞中NO 的合成和释放增加，过量NO 导致细胞损伤、组织坏死，进而促进炎症的发生和发展。经过体外的筛选，倒心盾翅藤二氯甲烷部位可以抑制巨噬细胞的活化，减少NO 的释放，因此进一步通过体内动物实验研究其对马兜铃酸肾病的肾保护作用。

本研究利用关木通水提物灌胃复制了大鼠急性马兜铃肾病模型，造模7 d 后，大鼠24 h 尿蛋白量增加，血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，说明肾脏出现损伤的同时伴有体内的炎症反应。模型组大鼠肾脏病理表现主要为急性肾小管坏死，肾小管上皮细胞崩解脱落，裸基底膜形成，细胞碎屑充填肾小管腔，肾间质水肿，细胞浸润。经过阳性药或者倒心盾翅藤二氯甲烷部位干预后，24 h尿蛋白量和血清中炎症因子水平降低，病理损伤有所减轻，提示倒心盾翅藤二氯甲烷部位的保护作用与抗炎存在一定关联。

p38 MAPK/NF-κB p65 信号通路是炎症反应中重要的信号通路，MAPK 激活后可以通过活化NF-κB，促进其转位到核内，从而调控靶基因的转录，促使下游多种炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等表达，诱导炎症反应的发生［19-20］。本研究结果表明，醋酸泼尼松和倒心盾翅藤二氯甲烷部位干预后，均能下调马兜铃酸肾病大鼠肾组织p38和p65 蛋白的磷酸化水平，从而抑制炎症因子IL-1β、TNFα、IL-6 的合成和释放。

综上所述，倒心盾翅藤二氯甲烷部位能减轻马兜铃酸引起的急性肾脏损伤，该作用与调控p38 MAPK/NF-κB p65信号通路，抑制炎症因子的产生相关。