基于TLR4 /MyD88/NF-κB 通路探讨茯砖茶改善ApoE-/- 小鼠非酒精性脂肪肝的作用

张文将，段丽芳，孟 涛，李 鑫，杨冬梨，刘圆月

（1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046； 2.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 413000；3.湖南省白沙溪茶厂股份有限公司，湖南 安化 413500）

非酒精性脂肪肝 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 为慢性进行性肝脏疾病，我国NAFLD 患病率高达29.2%，已经逐渐超越病毒性肝炎，成为我国第一大肝病，该病可发展为肝硬化甚至肝癌，同时NAFLD 的长期存在增加了动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 和2 型糖尿病罹患风险，且中晚期很难逆转，因此早期防治尤为关键［1-3］。“二次打击” 学说无法解释NAFLD 形成的复杂机制，“多重平行打击” 学说认为慢性、持续性、低度非感染性炎症反应为NAFLD 发展过程中的一个重要病理特征［4］。有研究证实长期高脂饮食可破坏肠黏膜屏障功能，大量内毒素随门静脉入血进入肝脏，激活肝实质细胞和肝库普弗细胞上的Toll 样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4） /髓样分化因子88 （myeloid differentiation factor88，MyD88） /核因子Kappa B （nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路，引起肝脏炎症反应和胰岛素抵抗的发生，促使脂质在肝脏的沉积，从而为NAFLD 的发生创造条件［5］。

NAFLD 防治尚无特效药物，抗氧化剂的应用为防治NAFLD 提供新思路。茯砖茶属于黑茶类，除了具有抗氧化作用的茶多糖及茶多酚外，在发酵过程中形成了冠突散囊菌属等优势益生菌，是医学领域中具有应用潜力的微生物［6-7］。课题组前期实验证实茯砖茶可通过抑制甘油三酯合成，减轻机体炎症反应，抑制肥胖和AS 形成，降低肝重及肝指数，但是深入机制尚不明确［8］。因此，本研究通过高脂饮食连续喂养载脂蛋白E 敲除 （apolipoprotein E，ApoE-/-） 小鼠4 个月的方法复制NAFLD 模型，同时予以茯砖茶灌胃干预，检测TLR4/MyD88/NF-κB 通路上的关键因子的基因表达变化，以期为NAFLD 的早期防治提供新的实验依据。

1 材料

1.1 动物 50 只8 周龄SPF 级雄性ApoE-/-小鼠，体质量（20±5） g，品系名ApoE Cas9-KO，遗传背景C57BL/6； 10只8 周龄C57BL/6J 雄性野生型小鼠，购于南京大学生物模式中心［实验动物生产许可证号SCXK （苏） 2015-0001］。小鼠饲养于SPF 实验室，室内IVC 独立送风隔离笼，仪器压差20 Pa，相对湿度50% ～70%，温度（24±0.5）℃，昼夜光照节律，每笼5 只，各组小鼠定量喂养，自由饮水（Ⅲ级水），每2 d 更换1 次垫料，笼具及水瓶定期消毒。ApoE-/-小鼠采用高脂辐照饲料（含21%脂肪、0.15%胆固醇，货号H10141，北京华阜康生物科技股份有限公司） 喂养，饲料于-20 ℃下保存，取需用量于4 ℃冰箱中短期保存。

1.2 药物 2014 年茯砖茶（湖南省白沙溪茶厂），经湖南中医药大学刘柏炎教授鉴定原料为茶叶一级嫩料压筑而成，色泽黑褐，金花茂盛。阿托伐他汀（辉瑞制药有限公司，批号110590）。

1.3 试剂 TRIzol 试剂 （美国Invitrogen 公司，批号50175111）； 荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号A152172A）； 反转录试剂盒 （美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批号00692424）。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

1.4 仪器 Z32HK 型高速冷冻离心机（德国Hermle 公司）； BX-51 型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）； 核酸蛋白浓度测定仪（英国Bio-Drop 公司）； PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司）； 荧光定量PCR 仪（德国Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 药物制备 茯砖茶掰成分散片状后用无菌纱布包裹投入无菌烧杯中，加入实验用Ⅲ级水浸泡30 min （加水量没过茶叶2～3 cm），武火煮开后文火煎煮30 min，药液冷却后过滤，取汁； 二次煎煮加水量以淹没药包为准，沸腾后冷却，将2 次滤液合并，浓缩至所需体积，4 ℃冰箱保存备用，依据茶吸收实验推荐成人每日摄入量为10 g （166.7 mg/kg），参照人与小鼠体表面积换算得小鼠所需剂量为1.44 g/kg［9］，设置茯砖茶高、中、低剂量分别为2.16、1.44、0.72 g/kg。阿托伐他汀使用前将药片放入干净研钵中碾碎，加入生理盐水溶解，搅拌成混悬液，按10 mg/kg剂量进行灌胃，现配现用。

2.2 分组、造模与给药 将50 只8 周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性饲养1 周后随机分为模型组（10 mL/kg 生理盐水）、阿托伐他汀组（10 mg/kg） 和茯砖茶高、中、低剂量组（2.16、1.44、0.72 g/kg），每组10 只，定量予以高脂饲料喂养； 另设同周龄雄性C57BL/6J 小鼠10 只作为空白组，定量予以普通维持饲料喂养。各组小鼠于每天早上9 点予以相应的药物连续灌胃干预17 周［10-11］。

2.3 标本收集与处理 各组小鼠给药第17 周末禁食不禁水12 h，麻醉后摘眼球取血，全血室温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min 离心15 min，取血清于-80 ℃冰箱中保存待测。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏称重，预冷生理盐水漂洗，取各组小鼠相同部位肝叶（约1 cm×1 cm×1 cm） 于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色； 取约100 mg 肝组织于盛有1 mL 预冷TRIzol 的无RNA 酶冻存管中，液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱中保存，用于RT-qPCR 检测。

2.4 HE 染色观察肝组织病理形态 肝组织于4 ℃、4%多聚甲醛中固定48 h，经常规脱水、包埋、4 μm 切片、烤片、染色后封片，于显微镜下观察。按照《NASH 临床研究网病理工作指南》 对NAFLD 活动度积分 （NAFLD activity score，NAS） 进行半定量分析［12］，具体评判标准为①肝细胞脂肪变，0 分（＜5%），1 分（5% ～33%），2 分（34% ～66%），3 分（＞66%）； ②小叶内炎症（20 倍镜计数坏死灶），0 分（无），1 分（＞2 个），2 分（2 ～4 个），3 分（＞4 个）； ③肝细胞气球样变，0 分（无），1 分（少见），2 分（多见）。

2.5 RT-qPCR 法检测肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表达 TRIzol 法提取肝组织总RNA，采用核酸蛋白浓度测定仪测定RNA 浓度和质量，按试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，反应程序为42 ℃，60 min；70 ℃，5 min； 4 ℃维持。随后进行PCR 扩增反应，反应程序为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，循环40 次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA 相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 统计学分析 通过SPSS 18.0 软件进行处理，实验数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 茯砖茶对小鼠肝组织病理形态的影响

3.1.1 肉眼观察 如图1 所示，空白组小鼠肝脏大小适中，暗红色，边缘锐利； 模型组小鼠肝脏体积增大，黄色油腻感，边缘较钝； 茯砖茶高剂量组小鼠肝脏稍大，暗红为主，色稍黄，边缘稍钝； 茯砖茶中剂量组小鼠肝脏体积适中，颜色暗红，边缘锐利； 茯砖茶低剂量组小鼠肝脏体积增大，颜色黄色油腻感，边缘变钝； 阿托伐他汀组小鼠肝脏体积变大，黄色油腻感，边缘钝。

图1 各组小鼠肝脏肉眼观察

3.1.2 HE 染色镜观察 如图2 所示，空白组低倍镜下肝小叶轮廓清晰，中央静脉居中，肝索放射状分布，肝血窦清晰； 高倍镜下肝细胞大小均匀，细胞核居中，胞质均质红染。模型组低倍镜下肝小叶轮廓模糊，肝索非放射状排列，肝血窦不清； 高倍镜下肝细胞体积变大，大小不一，界限不清，胞浆疏松化，有大量的空泡形成。茯砖茶高剂量组低倍镜下肝小叶结构完整，中央静脉居中，部分细胞核偏位，胞浆淡染疏松化； 高倍镜下肝细胞大小较均匀，细胞核居中，胞浆淡染，部分胞浆有少量空泡形成。茯砖茶中剂量组低倍镜下肝小叶结构完整，中央静脉居中，肝索呈放射状，肝血窦较为清晰； 高倍镜下细胞核居中、胞浆淡染疏松化，有部分体积较小空泡形成。茯砖茶低剂量组低倍镜下肝小叶轮廓及肝血窦欠清晰； 高倍镜下可见大量的空泡变性。阿托伐他汀组低倍镜下肝小叶轮廓及肝血窦纹理欠清晰； 高倍镜下可见胞浆淡染疏松化、细胞核偏位，存在大小不等的空泡形成。

图2 各组小鼠肝组织HE 染色

3.1.3 NAS 评分 与空白组比较，模型组小鼠肝脏NAS 评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和茯砖茶各剂量组小鼠肝脏NAS 评分降低（P＜0.05）； 与阿托伐他汀组比较，茯砖茶各剂量组小鼠肝脏NAS 评分降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠肝脏NAS 评分比较（±s，n＝10）

表2 各组小鼠肝脏NAS 评分比较（±s，n＝10）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阿托伐他汀组比较，△P＜0.05。

组别NAS 评分/分空白组0.00±0.00模型组6.72±0.49*阿托伐他汀组4.43±0.52＃茯砖茶高剂量组3.24±0.42＃△茯砖茶中剂量组2.92±0.57＃△茯砖茶低剂量组3.82±0.42＃△

3.2 茯砖茶对TLR4/MyD88/NF-κB 通路相关因子mRNA 表达的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组和茯砖茶各剂量组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表达降低（P＜0.05）； 与阿托伐他汀组比较，茯砖茶高、中剂量组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、FASmRNA 表达降低（P＜0.05），茯砖茶高剂量组小鼠肝组织IL-1βmRNA 表达降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表达比较（±s，n＝10）

表3 各组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表达比较（±s，n＝10）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阿托伐他汀组比较，△P＜0.05。

组别TLR4MyD88NF-κBIL-1βFAS空白组1.00±0.071.09±0.071.12±0.181.06±0.121.01±0.13模型组5.64±0.80*2.05±0.16*2.00±0.27*3.04±0.84*3.74±0.49*阿托伐他汀组3.55±0.45＃1.58±0.26＃1.60±0.20＃1.37±0.38＃2.32±0.44＃茯砖茶高剂量组1.96±0.54＃△1.35±0.12＃△1.34±0.28＃△1.14±0.17＃△1.42±0.20＃△茯砖茶中剂量组1.82±0.41＃△1.32±0.10＃△1.27±0.30＃△1.44±0.27＃1.21±0.19＃△茯砖茶低剂量组2.96±0.36＃△1.70±0.08＃1.58±0.34＃1.73±0.28＃△2.26±0.65＃

4 讨论

近年来提出的“肠-肝轴” 理论认为，肠道菌群失调在NAFLD 的形成中发挥着重要作用［13］。研究显示，NAFLD患者比正常人群更容易出现小肠细菌过度生长，导致富有脂多糖 （Lipopolysaccharide，LPS） 成分的细菌含量升高［14］。肠道内毒素通过门脉系统到达肝脏，被肝脏实质细胞中的TLR4或者Kupffer 细胞所识别［15-16］。LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路后促使大量炎症因子的释放，造成肝细胞的损伤［17］。通过阻断TLR4通路来抑制炎症反应，已经成为了干预肝脏疾病的有效途径之一［18］。

课题组前期实验证实，茯砖茶预防性灌胃给药可减轻NAFLD 小鼠肝脏氧化损伤［19］，降低血清IL-1β、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎症因子表达［8］，由此证实NAFLD 模型小鼠确实存在慢性非感染性炎症现象，而茯砖茶灌胃给药可以起到抑制炎症反应的效果，但其抗炎机制尚不明确。本研究结果显示，茯砖茶各剂量组和阿托伐他汀组预防性灌胃给药均可抑制小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表达，其中茯砖茶高、中剂量组抑制效果优于低剂量组和阿托伐他汀组，由此可见适当浓度茯砖茶预防性灌胃给药发挥着较好预防NAFLD 形成效果。阿托伐他汀为临床抑制胆固醇合成常用降脂药物，在本实验中虽可抑制NAFLD 形成，但其效果不如茯砖茶高、中剂量组，考虑可能是研究过程中阿托伐他汀所用剂量并非治疗最佳剂量所致。FAS 为催化乙酰辅酶A 和丙二酸单酰辅酶A 合成脂肪酸的关键限速酶，其表达量的增加会导致甘油三酯在体内的蓄积，由此可见FAS 系统在NAFLD 的发生与发展中起到关键作用［20］。本实验结果显示肝脏FAS基因表达和肝脏脂肪变性程度呈正相关，由此可见茯砖茶预防性灌胃给药可抑制肝脏脂类物质的合成，从而达到了延缓肝脂变的效果。

茯砖茶作为一种后发酵茶，有报道显示茯砖茶水提物可明显恢复高脂饮食小鼠引起的厚壁菌门/拟杆菌门比值的升高，提高双歧杆菌科细菌的相对丰度［21］。茯砖茶中的冠突散囊菌增加了小鼠肠道中产生乙酸和丁酸的细菌，可以部分逆转高脂饮食小鼠肠道菌群失调［22］。由此可见对肠道菌群失衡的调节可能是茯砖茶发挥作用的重要因素，但茯砖茶是否通过调节肠道菌群而抑制肝脏TLR4/MyD88/NF-κB 通路激活尚不明确，后续将完善通路关键因子蛋白表达实验，并配合细胞实验对该通路进一步验证。