基于“肾主骨生髓”理论观察补肾活血汤对绝经后骨质疏松症β-catenin 蛋白表达影响及相关性分析*

卢爱民，尹君，李春峰，龙大伟

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230000

2 安徽中医药大学附属太和中医院 安徽太和 236600

绝经后骨质疏松症是以绝经后女性为发病群体的全身性骨代谢性疾病[1]。骨形成和骨吸收失衡所导致的骨重塑负性平衡引起骨量的流失，骨组织微结构被破坏，易发生脆性骨折[2]。流调显示[3]我国50 岁以上女性群体骨质疏松症患病率达32.1%，显著高于欧美国家。预测显示[4]到2050 年中国≥50 岁人群骨质疏松症相关性骨折将达599 万例。而且骨质疏松性骨折是骨质疏松症的严重后果，特别是髋部骨折，具有高致死率及致残率[5]。尽管钙剂和骨吸收抑制剂双磷酸盐类是临床基础治疗和一线用药[6]，但其副作用也大大降低了患者的依从性。研究发现[7]补肾复方对免疫调节细胞、激素或细胞因子表达、骨代谢及多种信号通路的调节效果显著。凌家艳等通过补肾通络方对去势骨质疏松症模型大鼠的研究显示[8]补肾复方可有效改善去势大鼠性激素水平及骨密度，且可通过上调去卵巢大鼠子宫内膜雌激素受体（ERα）表达，调控Wnt/β-catenin 信号通路，起到干预PMOP 的作用。而且马陈等研究[9]发现青娥丸组PMOP 患者治疗后β-catenin 蛋白水平较治疗前显著升高。此外韩学明等在对PMOP 患者与健康绝经后女性的对比研究发现PMOP 组β-catenin 蛋白水平明显低于健康绝经后女性[10]。因此本研究基于“肾主骨生髓”理论观察补肾活血汤联合抗骨质疏松症药物对β-catenin 蛋白表达的影响并对其进行相关性分析。

资料与方法

1 诊断标准

参照原发性骨质疏松症诊断标准[2]：①绝经后女性；②髋部或椎体发生脆性骨折者；③中轴骨BMD 或桡 骨 远 端1/3BMD 的DXA 测T- 值≤-2.5；④BMD测量符合低骨量（-2.5＜T-值＜-1.0）同时伴脆性骨折（肱骨近端、骨盆或前臂远端）。（除①外另须符合②、③、④其中之一）

2 入组标准

2.1 纳入标准 ①符合如上诊断标准者；②辨证分型为肾虚血瘀证者；②患者年龄50 ～65 岁，且原发型绝经时间≥1 年；③参与本研究半年前无抗骨质疏松症相关治疗者；④自愿参与本研究并签署知情同意书者。

2.2 排除标准 ①伴有较严重心肺功能性异常或器质性病理改变者；②伴有肝肾代谢功能异常或近期服用激素制剂者；③伴有甲状腺功能异常者；④伴有胃肠功能明显异常者；⑤伴有精神障碍或认知异常者；⑥治疗周期内由于依从性等问题未能完成有效治疗者。

3 一般资料

2020 年9 月—2022 年6 月就诊于安徽中医药大学附属太和中医院骨科门诊或健康体检中心的PMOP患者中筛选符合纳入标准的72 例患者，采用随机数字表法随机分为观察组36 例和对照组36 例。观察组患者年龄50 ～62 岁，平均年龄（56.42±2.75）岁；绝经时间1 ～7 年，平均时间（3.33±1.74）年；体重指 数20 ～30kg/m2，平 均 指 数（22.61±2.82）kg/m2。对照组患者年龄50 ～61 岁，平均年龄（55.72±2.78）岁；绝经时间1 ～7 年，平均时间（3.78±1.69）年；体重指数20 ～31kg/m2，平均指数（23.25±2.97）kg/m2。2 组患者的一般资料进行统计学比较，差异均无统计学意义，治疗结果具有可比性。本研究经我院伦理委员会研究批准，且均获得了入组PMOP 患者同意并签署了知情同意书。

4 治疗方法

4.1 对照组 予以钙剂，碳酸钙片（珠海同源药业有限公司，国药准字H44024255，0.75g×30 片，片剂），每日3 次，每次1 片；骨吸收抑制剂，阿仑膦酸钠（北京福元医药，国药准字H20059029，70mg×4 片，片剂），每周1次，每次1 片。上述治疗药物连续服用周期3 个月，定期随访记录不良反应情况。

4.2 观察组 在对照组用药基础上予以补肾活血汤。补肾活血汤出自《伤科大成》，组方包括熟地、补骨脂、菟丝子各10g，杜仲、枸杞、归尾、山萸肉、苁蓉、没药、独活各3g，红花2g，由我院中药房统一煎煮，日1 剂，2 分服，连续服用3 个月。

5 观察指标与疗效评估

5.1 观察指标 包括①骨密度：腰椎L1-4BMD、左侧股骨颈BMD；②骨形成标志物 PINP；③骨吸收标志物S-CTX；④β-catenin 蛋白；⑤雌二醇E2；⑥中医证候量表总积分[11]，见表1。

表1 中医证候量表

5.2 检测方法 使用康源国际医疗器械公司DEXA双能X 线骨密度仪检测2 组患者治疗前后的腰椎L1-4BMD、左侧股骨颈BMD；抽取2 组患者治疗前后静脉血5mL（禁食水6h 后空腹静脉血），在3000 r/min 离心15 min 后收集血清，使用相应试剂盒（上海酶联生物科技有限公司提供）通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测PINP、S-CTX、β-catenin 蛋白水平；常规方法采血化验血清E2水平。

5.3 疗效评估标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[12]将临床疗效划分为痊愈、显效、有效、无效四级，采用尼莫地平法进行疗效评定。症状疗效指数（R）＝[（治疗前证候总积分-治疗后证候总积分）/治疗前证候总积分]×100%。痊愈：R ≥90%；显效：60%≤R＜90%；有效：30%≤R＜60%；无效：R＜30%。

6 统计学方法

使用SPSS25.0 软件进行数据统计分析，计量资料用（±s）表示，各组进行正态性、方差齐性检验，符合条件采用独立样本t检验，不符合采用曼-惠特尼秩和检验（Mann-Whitney U test）；计数资料比较采用χ2检验（四格表法）；相关性检验采用 Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 2 组治疗前后骨密度结果比较

2 组治疗前患者腰椎L1-4BMD 和左侧股骨颈BMD 进行组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），数据具有可比性。2 组治疗后患者腰椎L1-4BMD 和左侧股骨颈BMD 均较治疗前增高，差异有统计学意义（P＜0.05），且观察组指标水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 2 组腰椎L1-4BMD 和左侧股骨颈BMD 比较（±s）

表2 2 组腰椎L1-4BMD 和左侧股骨颈BMD 比较（±s）

BMD/g·cm-2 例数 观察组 对照组 t组间 P组间治疗前腰椎（L1-4） 36 0.664±0.039 0.659±0.033 -0.489 0.097治疗后腰椎（L1-4） 36 0.818±0.052 0.774±0.039 -4.023 0.001 t组内 -60.216 -65.366 P组内 0.000 0.000治疗前左侧股骨颈 36 0.709±0.044 0.708±0.039 -0.141 0.172治疗后左侧股骨颈 36 0.805±0.032 0.748±0.038 -6.869 0.000 t组内 -42.275 -25.690 P组内 0.000 0.000

2 2 组治疗前后骨转换指标（BTM）结果比较

2 组治疗前患者PINP 和S-CTX 表达水平进行组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），数据具有可比性。2 组治疗后患者PINP 和S-CTX 表达水平均较治疗前降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且治疗后观察组指标水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 2 组骨转换指标PINP、S-CTX 水平比较（±s）

表3 2 组骨转换指标PINP、S-CTX 水平比较（±s）

指标 治疗前后 例数 观察组 对照组 t组间 P组间PINP/ng·mL-1 治疗前 36 64.39±15.868 63.97±16.184 -0.110 0.854治疗后 36 43.78±8.333 49.56±10.840 2.535 0.017 t组内 14.358 14.818 P组内 0.000 0.000 S-CTX/ng·mL-1 治疗前 36 0.886±0.144 0.897±0.140 0.332 0.705治疗后 36 0.489±0.098 0.597±0.111 4.396 0.000 t组内 30.741 34.225 P组内 0.000 0.000

3 2 组治疗前后中医证候总积分比较

2 组治疗前患者中医证候总积分比较差异无统计学意义（P＞0.05），数据具有可比性。2 组治疗后患者中医证候总积分均较治疗前降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且观察组显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。中医证候总积分 例数 治疗前 治疗后 t组内P组内

表4 2 组治疗前后中医证候总积分比较（±s）

表4 2 组治疗前后中医证候总积分比较（±s）

观察组 36 15.56±4.01 7.58±3.64 27.109 0.000对照组 36 15.08±3.66 9.53±3.79 24.481 0.000 t组间 -0.522 2.221 P组间 0.303 0.018

4 2 组治疗前后β-catenin 蛋白表达水平、血清E2 水平比较

2 组治疗前患者β-catenin 蛋白水平、血清E2水平进行组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），数据具有可比性。2 组治疗后与治疗前β-catenin 蛋白水平、血清E2水平进行组内比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且治疗后观察组指标水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 2 组β-catenin 蛋白和血清E2 水平比较（±s）

表5 2 组β-catenin 蛋白和血清E2 水平比较（±s）

例数 观察组 对照组 t组间 P组间治疗前β-catenin/pg·mL-1 36 19.03±3.99 18.83±3.76 -0.213 0.780治疗后β-catenin/pg·mL-1 36 26.67±3.94 23.14±3.61 -3.963 0.001 t组内 -28.223 -32.855 P组内 0.000 0.000治疗前E2/pg·mL-1 36 12.14±3.31 12.42±3.51 0.346 0.651治疗后E2/pg·mL-1 36 18.64±4.66 16.19±4.29 -2.317 0.028 t组内 -25.026 -20.637 P组内 0.000 0.000

5 2 组治疗后有效率比较

2 组治疗结束后有效率进行比较，有效率包括痊愈率、显效率和有效率。观察组有效率为91.67%；对照组有效率为71.22%，观察组有效率明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明观察组疗效更优，见表6。

6 不良反应情况

2 组患者治疗期间均出现了两例患者呕吐不适的胃肠反应，观察组呕吐患者考虑是由于空腹服用中药汤剂引起的胃肠不适，且调整为餐后服用后未再出现；对照组呕吐患者考虑是由于较长期服用药物引起的不适。其他不良反应在治疗期间无明显表现。

7 β-catenin 蛋白与BMD、BTM、中医证候总积分、血清E2 治疗前后相关性分析

治疗前后72 例患者β-catenin 蛋白表达水平与各观察指标进行Pearson 相关性分析，与患者BMD、E2在治疗前和治疗后均呈正相关性（P＜0.01），与PINP、S-CTX、中医证候总积分在治疗前和治疗后均呈负相关性（P＜0.01），见表7。

表7 治疗前后β-catenin 蛋白相关性分析

讨 论

PMOP 在中医归属“骨痿、骨枯”范畴，中医病机主要为“肾虚精亏、髓减骨枯、筋骨失养”，与肾脏关系密切[13]。《素问·上古天真论篇》记载：“女子七岁，肾气盛，齿更发长……四七，筋骨坚，发长极，身体盛壮。”阐明肾精充足，则髓充骨坚。PMOP 的发病与肾精不足而致髓化乏源、骨失所养密切相关[14]。因此补肾填精是治疗PMOP 的基本治疗大法。此外研究显示补肾活血汤配合常规抗骨质疏松药物，对于抑制骨量丢失，改善骨微结构疗效显著，且具有高安全性、低副作用特点[15]。 本研究组方中熟地黄、山茱萸、杜仲、枸杞子、补骨脂、菟丝子补肾强筋而壮骨；当归、没药、红花活血祛瘀而新。且本研究结果显示补肾活血汤可显著提高患者骨密度水平，改善患者中医证候表现，这与王俊杰研究结果基本一致[16]。此外观察组患者治疗后血清E2水平较治疗前明显提高，表明补肾活血方可有效改善患者雌激素低水平状态。李莉等在对OVX 大鼠模型研究[17]亦发现补肾法六味地黄汤可显著提高其血清E2水平，改善骨密度，推测与其类激素样作用密不可分。Wei 等通过对单味补肾药淫羊藿有效成分淫羊藿苷的研究发现[18]其可以显著上调成骨基因ERα 和Wnt 信号通路蛋白β-catenin 的表达，进而调节BMSCs 的成骨分化。这表明补肾类单味药或复方对雌激素的正向调控作用。

此外骨转换高速率的增加是骨量流失的主要原因[2]，而骨转换标志物（BTM）作为评估PMOP 治疗效果的生化标志物较BMD 而言更加敏感，此外还可以有效预测骨折风险。国际骨质疏松症基金会（IOF）建议在骨质疏松症的临床研究中使用骨形成指标PINP 和骨吸收指标S-CTX 作为疗效参考指标[19]。且本研究结果显示补肾活血汤联合疗法显著降低了BTM 表达水平。这与段俊红等对肝肾阴虚型PMOP 患者的治疗效果基本一致，均显著改善了BMD 和BTM 水平[20]。

而β-catenin 蛋白作为经典Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白，其通过调控抑制骨髓间充质干细胞的脂肪分化，促进成骨分化机制减少或抑制骨量流失[21]。Xia 等通过补肾活血方的研究发现与OVX 小鼠相比，灌胃补肾活血方小鼠的β-catenin 和ALP mRNA 表达显著增强，而FABP4 mRNA 则显著降低，呈现抑制骨量流失、改善骨微结构、抑制脂肪分化效应，但敲除β-catenin 表达基因的OVX 小鼠其β-catenin 蛋白表达量及成骨细胞增殖分化情况较未敲除小鼠显著降低，表明补肾活血方的抗骨质疏松作用主要通过β-catenin 信号传导起作用[22]。本研究结果显示观察组β-catenin 蛋白表达水平效应更明显。此外许兵等通过补肾活血含药血清培养体外成骨细胞研究发现[23]含药血清组β-catenin、Runx2 及Osx mRNA 表达量显著提高，且成骨细胞的增殖分化活性明显高于对照组，可以推测补肾活血颗粒通过激活经典Wnt/β-catenin 信号通路增强了成骨细胞增值分化的效应。这表明补肾活血方可有效改善PMOP患者体内β-catenin 蛋白低表达水平，进而激活Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨分化。此外本研究通过对2 组患者治疗前后体内β-catenin 蛋白表达水平进行的Pearson 相关性分析表明其作为Wnt 信号通路的关键蛋白，其表达水平的高低与降低PMOP 患者骨量流失，提高患者体内雌激素水平，降低骨转换率，改善患者中医证候关系密切。

综上，补肾活血汤联合常规抗骨质疏松药物能够有效增加PMOP 患者骨密度，促进骨重塑正性平衡，提高患者体内E2水平，改善患者中医证候，促进β-catenin 蛋白表达，有效调控Wnt 信号通路，有利于PMOP 的防治。