“黄芪-肉桂”药对治疗前列腺增生的分子机制探讨*

胡芳，朱闽，张泽朝，杨青云，张禹姝

1 广西中医药大学 广西南宁 530000

2 广西中医药大学附属瑞康医院 广西南宁 530000

BPH是中老年男性最常见的疾病之一[1]，因前列腺上皮和基质细胞的过度增殖导致腺体增大引起的下尿路症状是其主要临床表现[2]。现代医学治疗BPH 的常用药物是5α 还原酶抑制剂和α 受体阻滞剂，均需要长期用药，且有一定的不良反应发生[3]。BPH 属中医“癃闭”“精癃”范畴，诸多古代文献及现代研究表明，中医药治疗本病有一定的优势和潜力[4]。

肾虚血瘀证的BPH 最常见的临床证型，以温补肾阳、活血化瘀为治疗原则[5]。肉桂-黄芪是张春和教授治疗肾虚瘀阻的BPH 喜用药对且是根据数据挖掘治疗前列腺增生支持度最高的药对[6]，有临床研究发现用黄芪和肉桂配对使用的如前列通窍胶囊、补肾消癃方治疗肾虚血瘀证的BPH 安全有效[7-8]。但当前黄芪和肉桂两味配对治疗BPH 的作用机制尚未完全清楚，因此本研究将应用网络药理学与分子对接揭示黄芪-肉桂治疗BPH 的活性成分及药效机制，为其临床使用提供生物学信息支持和为后续基础研究提供参考。

材料及方法

1 中药化学成分与靶点的搜集

从TCMSP 平 台（http：//lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）中以及文献补充检索黄芪、肉桂，筛选条件设置为口服利用度（oral availability，OB）≥30%及类药性（drug-likeness ，DL）≥0.18，再将筛选得到有效成分通过其MOL.ID 号搜寻单味药成分作用靶点。剔除重复作用靶点后将靶点信息经Uniport 数据库标准化。

2 构建“中药-成分-靶点”网络图

利用Cytoscape 3.8.2 软件将得到黄芪-肉桂有效成分和作用靶点的相互作用制作中药“有效成分-靶点”网络图。

3 中药与BPH 共有靶点的收集

以“Benignprostatichyperplasia”为 关 键 词，分别 运 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Durgback（https：//go.drugbank.com/）平台检索 BPH 相关靶点。将筛选得到的BPH 靶点删除重复靶点后和黄芪、肉桂靶点 导 入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网站得到交集靶点。

4 PPI 网络构建及网络拓扑分析

将黄芪- 肉桂与BPH 的交集基因导入String（https：//string-db.org/）数据库，设置对象为（homo sapiens）、取最高置信度0.900，隐藏游离基因节点，然后得到蛋白互作关系。结果导入Cytoscape3.8.2 软件中，选择”network Analyzer”，得到网络拓扑学参数。介度中心值（Betweennesscentr ality.BC）最短路径穿过单个节点的次数，紧密中心值（closeness centrality.CC）是节点间沟通的难易程度。把Degree 值的二倍中位数以上，BC 和CC 的中位数上作为衡量标准筛选养中药与疾病的核心成分靶点，并制作PPI 网络互做图。

5 GO 和KEGG 富集分析

通过Metascape（http：//metascape.org/）平台进行GO（gene ontology）功能、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，将所得交集靶点导入基因列表中，设置对象为”human”，选择个性化分析，设置最小重叠为（Min Overlap）为3、P值取0.05、最低浓缩度为1.5。得到结果后，制作GO 富集分析图和KEGG Pathway 通路图。

6 分子对接

通 过Cytoscape3.8.2 软 件 中”network Analyzer”功能分析得到degree 值和中间介度值排名第一的中药成分选为中药大分子受体。通过TCMSP 数据库获取成分小分子配体结构，并利用PDB（http：//www1.rcsb.org/）平台获取核心蛋白大分子受体结构。蛋白质 晶 体 结 构 由RCSB PDB 数据 库（http：//www.rcsb.org/）获取（PDB 编号：）。将大分子和小分子导入AutodockTools1.5.6 软件中进行对接验证。经过去水，加氢处理后，并进行受体结构准备工作。使用Open Babel 及Autodock vina 程序对小分子库进行拆分等准备工作。最后导入pymol 进行对接结果的可视化。

结 果

1 黄芪、肉桂有效成分和靶点的获取

从TCMSP 数据库中，以OB ≥30%和DL ≥0.18为筛选条件，得到20 种符合条件的有效成分。通过文献搜索肉桂有3 个成分，虽不符合筛选条件，但具有较好的抗前列腺增生的作用，也纳入研究。黄芪-肉桂成分作用靶点经合并去重后得到206 个靶点。黄芪-肉桂有效成分基本信息见表1。

表1 黄芪-肉桂有效成分表格

2 构建中药“有效成分-靶点”网络图及关键化合物筛选

采用Cytoscape3.8.2 软件，绘制中药“有效成分-靶点”网络图（见图1），共221 个节点（Nodes），434 条边（Edges）。根据Degree 值排序得到前3 的成分化合物为懈皮素、山柰酚、油酸。见表2。

图1 中药“有效成分-靶点”网络图

表2 前3 化合物Degree 值表

3 疾病和交集基因的获取

经GeneCards、OMIM、Durgback 平 台 获 取BPH靶点4468 个，其中最大score 评分为94.51，最小评分为0.14。对所得数据卡两次中位数和删除重复值后得到3951 个疾病靶点。黄芪-肉桂与BPH 靶点取交集，得到交集基因165 个。韦恩图见图2。

图2 中药-疾病靶点韦恩图

4 PPI 网络制作和核心蛋白的获取

经String 平台分析隐藏游离节点后得到114 个节点，1721 条边，平均节度点为9.28。下载TSV 文件导入Cytoscape3.8.2 后经网络拓扑学分析，把Degree值的二倍中位数以上，BC 和CC 的中位数上靶点作为中药复方的核心作用靶点，根据拓扑学参数分析，前五靶点基因为AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF。随着Degree 值和连接分数的增高，节点的形状越大，颜色越鲜明、线条越粗，蛋白的地位也就越重要。见图3。

5 GO 与KEGG Pathway 富集分析

经Metascape 平台分析，GO分析结果显示：生物过程（Biological Processes.BP）4172 条、分子功能（Molecularfunction.MF）503 条和细胞成分（Cellular Components.CC）共285 条。BP、MF 和CC 分别前10条见图4。BP排名靠前的为活性氧代谢过程、对药物的反应、对类固醇激素的反应、细胞对化学应激的反应等。MF 主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性等。CC 主要由突触后膜、受体复合体、细胞质核周区域、转录因子复合体等构成。提示黄芪-肉桂可能通过调控细胞核转录因子、参与脂多糖等反应来干预治疗BPH。

图4 GO 富集分析图

为了探讨黄芪-肉桂在BPH 治疗中的信号通路机制，我们进行了KEGG 富集分析。如图5 所示，显示了前20 条信号通路，包括IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。

图5 KEGG Pathway 富集分析图

6 化合物靶点-核心蛋白分子对接验证

将筛选得到黄芪-肉桂的拓扑学参数排名第一的中药化合物小分子槲皮素，PPI 核心蛋白拓扑学参数第一的大分子受体（AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF）由AutodockTools1.5.6 软件进行分子对接。化合物与蛋白质的对接结果见表3。结合能＜-1kcal.mol-1，提示具有结合活性。随着结合能越低，受体与配体之间的亲和力越高，构象越稳定。根据结果显示，分子对接结合热能都＜-1kcal.mol-1，说明自发间可以相互结合，其中槲皮素与TNF（-7.16）的结合热能最低，表示结合活性较最好，导其入pymol 进行对接结果的可视化，结果见图6。

图6 槲皮素与TNF 的分子对接示意图

表3 分子对接结果

讨 论

BPH 是一种良性增生性疾病，在临床上治疗本病有症状复杂和缠绵难愈的难点[4]。现代医学BPH 的发病机制尚未完全揭示，可能与激素、炎性反应、血管生长和细胞增殖与凋亡障碍有关[9]。然而，临床上缺乏特殊的治疗方法[10]。BPH 在中医上属“癃闭”“精癃”范畴，肾虚血瘀是其发病的基本病机也是临床上最常见的证型[8]，以温补肾阳，活血化瘀为治则。黄芪在《本草逢源》中记载黄芪有“补肾中气不足”和“而能通调血脉，流行经络”之效，因此其能益气活血。肉桂有补火助阳，引火归原，散下焦之阴寒，助膀胱气化之功，因而黄芪和肉桂配合使用则能达温补肾阳，活血化瘀之功。但黄芪-肉桂治疗BPH 的现代医学确切作用机制尚不明确。因此，有必要利用网络药理学和分子对接探索该药对在BPH 治疗中的作用机制。

通过对黄芪-肉桂“有效成分-靶点”网络图，我们得到黄芪-肉桂化合物治疗BPH 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、油酸等。槲皮素和山柰酚均属于黄酮类药物，都具有抗炎和抗氧化的功效[11]，研究表明，槲皮素可降低BPH 患者前列腺症状评分和提高尿流量[12]，山柰酚能明显降低BPH 大鼠前列腺指数，改善BPH 大鼠的病理结构[13]。两者都能减少前列腺上皮细胞的增殖，降低PSA 水平和AR 基因的表达[13-14]。油酸可抑制BPH 大鼠的LNCaP 增殖[15]和5a-还原酶活性（5AR）[16]。

在黄芪-肉桂对BPH 起治疗作用的114 个靶点的PPI 网络中，AKT1、IL6、P53、TNF 等是基于节点度前5 个靶点。根据分子对接也证明AKT1、IL6、P53、TNF 与黄芪-肉桂具有结合活性，因此这些靶点可能在黄芪-肉桂治疗BPH 中发挥重要作用。上述靶点主要与细胞增生与凋亡、炎性反应有关。Akt1 是一种多功能蛋白质，与细胞生长，存活和增殖的调节有关[17]。Akt1 在正常的前列组织中有表达[18]，AkT-1 表达升高会增加BPH 患者的前列腺大小[19]。p53 蛋白是一种抗凋亡蛋白，在BPH 大鼠中p53 的mRNA 表达较正常组大鼠会下降[20]，p53 的表达下降会促进BPH 上皮细胞生长[21]。IL6 和TNF-α 是促进前列腺上皮细胞增生的促炎蛋白[14]，临床上发现BPH 患者IL-6、TNF-α 的水平显著升高[22]，并且有研究发现IL-6 水平与PSA、PSAD 表达[23]以及TNF-α 浓度与PV 、前列腺症状评分均呈正相关[24]。有研究表明肉桂中的肉桂醛可显著降低BPH 大鼠IL-6、TNF-α 水平，降低前列腺增生指数和减轻前列腺结构组织病理学变化[25]。

根据KEGG 分析得到黄芪-肉桂治疗BPH 主要途径包括IL-17 信号通路、TNF 信号通路、HIF 1 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等。在IL-17 信号通路[26]和TNF 信号通路[27]中，IL-17 和TNF-α 都是多功能促炎细胞因子，参与宿主防御、炎性反应疾病等过程。与健康患者相比，BPH 患者IL-17、TNF-α 表达明显升高[28]。IL-17[29]和TNF-α[30]的表达升高可以通过刺激 IL-6 和 IL-8 的产生，从而促进BPH 中基质和上皮生长[29]。HIF-1 信号通路促进血管生成，它有助于包括BPH 在内的诸多增生性疾病的进展[31]。升高的HIF-1α 能上调BPH 大鼠前列腺组织中VEGF 和 bFGF 的表达进而诱导血管内皮诱导增殖、迁移、存活、发芽并最终扩展原始血管网络[32]，为生长中的前列腺细胞的存活提供营养支持和氧化作用[7]。PI3K-Akt 信号通路有促进细胞增殖且抑制细胞凋亡的作用[33]，研究发现BPH 患者前列腺组织中P13 和AKT 表达水平升高，并与前列腺体积正相关[12]。MAPK 信号转导通路在细胞生长、分化、凋亡等生物过程中发挥关键作用[34]。MAPK 信号通路分支包括ERK、p38 和JNK 等。其中ERK 激活主要控制细胞增殖和分化及抗细胞凋亡的功能，p38 和 JNK 激活往往与促细胞凋亡的作用相关[35]。实验表明BPH条件下ERK 表达水平明显升高，p-JNK 和p-p38 表达水平显著下降[36]。p38 表达升高能抑制BPH-1 的生长并增加细胞凋亡[34]。

综上所述，黄芪-肉桂中的槲皮素、山柰酚、油酸等有效成分可能通过作用于AKT1、IL6、P53、TNF 等靶 点，调 控IL-17、TNF、 HIF 1、MAPK 和PI3K-Akt等信号通路以影响可能会导致前列腺增生的原因如雄激素/AR 信号通路激活升高、炎性反应及血管增生来抑制前列腺体积的异常增大和改善BPH 患者临床症状等作用。