基于网络药理学初探桃红四物汤治疗股骨头坏死机制及实验验证*

荣尚，吴智恒，马文元，吴睿哲，吴洁，孙绍裘

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第二附属医院 湖南长沙 410005

股骨头坏死是因各种原因引起的股骨头血供的中断或者破坏，从而引起股骨头里面骨细胞和骨髓成分的破坏、死亡的一种常见骨科疾病。学者们提出了的一些潜在机制有骨细胞凋亡、细胞分化紊乱、血管生成障碍等[1]。美国，每年约有2 万至3 万名患者被诊断。目前各种治疗方法中，核心减压是治疗塌陷前股骨头坏死最常用的治疗方法，可缓解骨病早期的疼痛[2]。在中国已大约有800 万人患有股骨头坏死，约有10%的创伤性患者需要进行人工全髋关节置换手术，造成严重的经济和社会负担。中医药治疗具有不良反应小、小创伤、可以有效缓解患者症状等优点，成为现在临床一线首选方案[3]。

现有大量文献和实验表明桃红四物汤可通过诱导局部血管新生及新骨生成从而促进骨损伤的修复与重建，涉及TGF-β、MAPK、Notch 等多条信号通路[4]。TGF-β 下游分子骨形态发生蛋白相关的BMP/Smad 是一条重要的诱导成骨形成的信号通路。但关于中医药在此信号通路相关研究文献的报道较少。故通过BMP/Smad 信号通路探究桃红四物汤对创伤性股骨头缺血性坏死模型大鼠成骨相关因子的影响，揭示桃红四物汤对本病的疗效机制，为防治股骨头坏死提供新的治疗策略。桃红四物汤这一经典名方最早见于清代的《医宗金鉴》，该方开始的用途是用来治疗血瘀所致的月经先期及骨关节炎[5]。相关研究已经证明，桃红四物汤可有效抑制膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨中基质金属蛋白酶的表达，并降低局部组织中白细胞介素的水平，减轻关节炎症[6]。中医药治疗疾病的特点是揣外之内、见微知著。结合骨伤科特点，进行先辨病再局部辨证，最后通过灵活药物的搭配，从整体疾病的角度出发，实现对机体紊乱的调节[7-8]。我们尝试通过对GO 富集分析及KEGG 通路的分析和细胞实验，进一步研究THSWD 治疗股骨头坏死的潜在机制，并进行初步的实验验证。为研发THSWD 的有效成分和提供更广的应用。

资料与方法

1 数据来源

本项研究中所使用的网络数据库及应用软件如下：囊括了药物、靶标和疾病之间的关系的中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、人类基因数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据系统（OMIM）、STRING 平台、Cytoscape 软件、Python3.6 编程软件、Jamovi 2.3.13 统计软件。

2 桃红四物汤有效成分库及靶基因库构建

登录TCMSP 数据库，分别以“桃仁”“红花”“熟地黄”“当归”“芍药”“川芎”检索药物所含的有效成分，并进行初步筛选。进入人体的药物要经过吸收、分布、代谢和排泄等过程才能到达靶器官发挥药效作用，DL、OB 是中药有效的活性成分参与ADME 过程的关键参数。条件为：OB（口服生物利用度是指一种药物在摄入后进入体内循环的量）＞30%，生物类药性（DL）＞0.18，获取符合条件的活性成分。并通过Python 编程软件构建靶基因库。

3 股骨头坏死靶基因库

构建以“Osteonecrosis of the Femoral Head”为关键词的基因数据库。以“Osteonecrosis of the Femoral Head”为关键词分别在 GeneCards 数据库、 OMIM 数据库检索疾病基因。删除重复性，合并所查得的有关股骨头坏死的靶基因，筛选并构造股骨头坏死疾病对应的靶基因库。

4 交集基因库构建

使用 Python 编程软件，获得桃红四物汤有效成分治疗的靶基因与股骨头坏死对应的靶基因的交集基因，并绘制 Veen 图，筛查出共同靶点基因。

5 药物成分-靶基因-疾病调控网络的构建

利用Cytoscape 软件对 STRING 网站物种设置为“Homo sapiens 得到的结果与桃红四物汤有效成分以及共同靶点基因进行分析，构建药物成分-靶基因-疾病调控网络，以介数和自由度的均值作为截点，将截点之上的靶点作为关键靶点，并分析其药理作用。

6 GO 功能富集分析与 KEGG 通路富集分析

将所得到的桃红四物汤-股骨头坏死共同靶点基因进行整理格式，通过David 分析平台进行GO 、KEGG 分析。David 数据库是一个基因功能注释分析工具，可以实现基因功能注释，并进行基因相关的蛋白质网络分析。

7 细胞试验

7.1 CCK8 检测 将大鼠BMSC 细胞培养于含10%FBS+1% 双 抗 的DMEM/F-12 中 培 养。分3 个组处理，分别为BMSC 组、BMSC+15% 桃红四物汤血清组、BMSC+BMP 抑制剂UK383367 组。加入含有CCK8 的培养基，孵育后于Bio-Tek 酶标仪分析450nm 处吸光度（OD）值，来测定细胞活力。

7.2 Western Blot 将BMP-2（美国proteintech 公司提供抗体）、BMP-4（博奥森公司提供抗体）、Smad1（美国proteintech 公司提供抗体）、Smad5（博奥森公司提供抗体）、Smad8 （博奥森公司提供抗体）、Runx2（博奥森公司提供抗体）、Osterix（英国abcam 公司提供抗体）、β-actin（美国proteintech 公司提供抗体）等在细胞中的表达蛋白提取后，按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书的规范操作，测定蛋白浓度。将样品准备好后，进行转膜及封闭。最后显色曝光。

结 果

1 桃红四物汤有效成分库及靶基因库

筛选标准为：OB 值≥30%，DL 值≥0.18；检索TCMSP 数据库后共得到62 个有效成分，196 个对应靶点。为了证实THSWD 对股骨头坏死具有良好的治疗作用，我们利用不同的数据库收集了862 个不同的股骨头坏死靶基因和196 个THSWD 靶基因。通过对它们的交叉点，我们得到了65 个共同的靶基因，见表1，图1。

图1 韦恩图

图2 靶点基因网络

表1 桃红四物汤有效成分

2 网络构建与分析

图中节点为靶点及化合物，Degree 值越大则节点越大、颜色越深，表示该节点与其他节点之间的关系越紧密，结合相关文献，得出桃红四物汤治疗股骨头坏死的核心靶点为PTGS2 、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等。蛋白质基因之间的相互作用来自已经证实研究的系统数据库。蛋白质共同工作，以促进共享的功能；利用 Cytoscape3.8.软件建立活性成分与靶点相互作用网络，如图3，共有91个节点和181 条边。根据Cytoscape 网络图，核心有效化合物为MOL000098 槲皮素、MOL000006 木犀草素、MOL002714 黄芩素、MOL000422 山奈酚、MOL002773β-胡萝卜素。

图3 KEGG 通路富集

3 GO 富集与 KEGG 信号通路富集

疾病的发生和药物的治疗是多个尺度上相互作用的动态过程，包括DNA 损伤、基因突变、细胞周期行为、种群动态、炎症、代谢-免疫平衡。为了探讨THSWD 对股骨头坏死的动态演变过程。通过微生信平台进行了GO 与 KEGG 信号通路富集分析如图4-7。以P＜0.05 作为筛选条件，筛选出前 20 位的基因本体和前 30 位 KEGG 通路，p 值越小、柱状图颜色越红说明富集程度越显著。KEGG 富集分析得到131 条通路，其中有 105 条信号通路 P-Value＜0.01，对 P 值及富集显著的前 30 条信号通路进行分析如图所示，结果表明富集显著的信号通路主要有MAPK 信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路、IL-17信号通路、TNF 信号通路、糖尿病并发症中的AGERAGE 信号通路等。GO 注释结果显示桃红四物汤的65 个关键靶点富集显著的前10 个生物学功能：凋亡过程、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、对外来刺激的反应、血管生成、凋亡过程的正调控、对药物的反应、缺氧反应；位于前10 的细胞组分：细胞质、质膜、外泌体 、 细胞内膜细胞器、线粒体、细胞胞外区、细胞表面、 高分子复合物、粘着斑、细胞外间隙 ；位于前10 的分子功能：蛋白质结合、相同蛋白结合、转录因子活性，序列特异性DNA 结合、高分子复合物结合、蛋白质同二聚体活性、生长因子活性、丝氨酸型内肽酶活性、酶结合、内肽酶活性、血红素结合。综上提示THSWD 可通过调控多个生物过程治疗股骨头坏死。

图4 生物学功能GO 富集图3 KEGG 通路富集

图5 细胞组分GO 富集

图6 分子功能GO 富集

4 细胞验证实验

4.1 细胞增殖率 大鼠BMSC 细胞活力在培养24h时（见图7、图10），且差异与其他2 组具有统计学意义。说明桃红四物汤对BMSC 细胞增殖抑制率随培养时间延长呈逐渐升高趋势。

图7 细胞增殖率

图8 western blot 蛋白表达

图9 各蛋白灰度分析

图10 CCK8 检测

4.2 蛋白的相对表达量 BMP-2，BMP-4，Smad1，Smad5， Smad8，Runx2，Osterix 在BMSC+15%桃红四物汤血清组中的表达量均高于BMSC 组、BMSC+BMP抑制剂UK383367 组，提示桃红四物汤可促进以上蛋白的表达，将曝光后的底片扫描，并用quantity one 专业灰度分析软件进行分析。并用jamovi 2.3.13 软件进行绘图（见图8、图9）。给药 48 h 后，随着药物浓度增加，与空白组及对照组相比，桃红四物汤组均显著 升 高 了BMP-2、BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8 、Runx2、Osterix 蛋白水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示桃红四物汤对BMSC 的增殖作用可能与上调上述蛋白水平有关。

总 结

股骨头坏死是一种常见的骨科疾病，治疗难度大，发病率高。股骨头坏死病因复杂且危害严重，目前尚无特效药物。如果没有完全治愈的方法，对于年轻患者，特别是青少年，手术干预保留髋关节更合适[9]。股骨头坏死是一种进行性发展的骨科疾病，因此，减缓或逆转其病变进展是至关重要的。《素问·宣明五气》云：“血气不和，则变生百病。 ”中医治疗骨痹早期以活血化瘀为主[10]。 桃红四物汤作为活血化瘀的经典方剂，历来被认为是治疗骨痹的代表方。在这一方面，桃红四物汤治疗骨伤科疾病的作用越来越受到重视。桃红四物汤是治疗血瘀疾病的千古名方，但治疗股骨头坏死的作用机制尚不明确。

我们尝试运用构建“成分-疾病-靶点”中药复方调控网络，根据初步筛选得到62 个有效化合物，65个靶点，根据cytoscape 互作网络图得出桃红四物汤防治股骨头坏死的有效成分为槲皮素、木犀草素、黄芩素、山奈酚、β-胡萝卜素。并且其中多数化合物归属于桃仁、红花此两味药材，这与临床上中医药治疗股骨头坏死的用药频率一致，体现了活血化瘀的特点。

此外，拓扑分析发现PTGS2、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等是关键靶点。前列腺素内过氧化物合酶（Prostaglandin-Endoperoxide Synthases ，PTGS），又称环加氧酶。 PTGS 有两种同工酶：组成型PTGS1 和诱导型PTGS2。PTGS 与炎症和有丝分裂发生相关的前列腺素生物合成有关[11]。是几种炎性前列腺素合成过程中催化限速步骤的关键酶，是重要的炎症相关靶点，罗铭然等研究证实 PTGS2 、PTGS1 通过抑制下游炎症通路从而对 MC3T3-E1 细胞成骨分化起重要的调控作用[12]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是哺乳动物免疫反应的关键介质和调节器。TNF 控制免疫系统的发育、细胞存活信号通路、增殖和调节代谢过程[13]。TNF-α 通过作为三聚体结合到55 kDa 细胞膜受体TNFR-1 或75 kDa 的细胞膜受体TNFR-2 发挥许多作用。TNF 诱导的信号转导途径通过参与所有TNF 依赖性膜相关和细胞内蛋白信号复合物的分子泛素化和磷酸化受到严格调控[14]。血管内皮生长因子（VEGF）是一种与血管和淋巴管生成密切相关的相关因子[15]。特别是VEGFR2 具有较强的酪氨酸激酶活性；VEGFR1 可刺激各种组织中炎症反应，并通过促血管生成、肿瘤转移、淋巴管生成、关节炎和动脉粥样硬化促进多种疾病的发生发展[15]。VEGF 系统对于骨髓修复重建和伤口愈合等方面也扮演着至关重要的角色[16-17]。

GO 功能注释及 KEGG 通路富集结果表明，筛选所得关键靶点主要涉及免疫反应、氧化应激反应、炎症反应、信号转导等一系列生物学反应过程。结合相关文献，推测桃红四物汤治疗股骨头坏死的信号通路为MAPK 信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路。

在严重缺氧时，缺氧诱导因子（HIF-1）被激活，作为转录因子，调节机体的代谢和功能，以适应缺氧情况[18]。有研究表明，缺氧通过激活HIF-1-EPO 通路导致EPO 水平升高，EPO 会上调EPO 通过促进有丝分裂来促进EPC 和ST2 的增殖，而不影响细胞凋亡。血管生成和成骨相关因子的蛋白和mRNA 水平表达量升高。从而促进骨缺损模型的新骨形成[19]。

NF-κB 是一种调节骨形成炎症反应和骨重塑过程的转录因子。NF-κB 家族可以选择性的结合在B细胞κ-轻链增强子上调控[20]。NF-κB 信号通路的关键靶点是IL-1R、TNF-R1、TLR4、RANK，主要参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等过程[21]。相关证据表明，NF-κB 通过同时调节炎症和骨重塑过程，是炎症相关骨疾病的重要潜在治疗靶点[22]。近年来，具有不同方法调节NF-κB 活性的新型抑制剂，以及控制释放或骨靶向药物传递策略的发展，极大地增加了NF-κB 治疗在骨疾病中的应用[23]。

白细胞介素（IL-17）是触发炎性骨丢失的重要促炎细胞因子。IL-17 细胞因子家族由6 个成员组成，IL-17A 到IL-17F，主要由T 辅助细胞17（Th17）细胞分泌[24]。IL-17A 诱导TNF、IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL8、CXCL10、MMPs 的表达。IL-17A 在调节骨重塑中发挥重要作用。病理性骨吸收是由破骨细胞分化和/或活性增加引起的。IL-17 通过协调破骨细胞的分化和激活，对维持骨量至关重要[25]。IL-17 通过激活核因子κ-B 的RANKL 受体激活因子-骨保护素系统来诱导破骨细胞的形成[26]。IL-17 还通过诱导IL-1 和TNF-α 的表达间接促进破骨细胞的形成，并与TNF-α 协同参与破骨细胞分化和骨吸收[27]。

TNF-α 是骨重塑的调节因子，它是病理性骨丢失的核心作用，因为它降低成骨细胞的活性和存活，增加破骨细胞的分化、招募和活性[28]。TNF-α 在骨中的所有功能都依赖于TNFR1。TNF-α 是一个大型细胞因子家族的原型，它作为三聚体与跨膜受体结合，激活各种细胞信号通路[29]。TNF-α 也是急性或慢性炎症以及宿主对病原体的防御的主要调节因子。TNF-α 对体外成骨形成的明显作用是通过抑制骨形成必不可少的两种转录因子的表达： Runx2 及其下游靶点Osterix 的表达来阻断成骨细胞分化[30]。在分子水平上，TNF-α 在多个水平上阻断Runx2 的表达。它抑制runx2 的转录，使其信使不稳定，并通过上调E3 泛素连接酶Smurf1 和Smurf2 来促进runx2 蛋白的降解。此外，TNF-α 还可以刺激NF-κB 激活，抑制TGF-β/bmp 诱导的成骨细胞Smad 信号通路，降低Runx2 的表达。

MAPK-细胞外信号调节激酶（ERK）通路是细胞表面和细胞核之间调节增殖和分化迁移以及细胞死亡的重要环节。此外，MAPK 通路在骨形成中起着关键作用，因为它可以与所有的分子通路进行串联[31]。在另一项研究中，系统分析使用基因微阵列分析和生物信息学分析表明，MAPK 信号通路激活氧化铁纳米颗粒治疗人类骨源性间充质干细胞，促进成骨分化[32]。

如 下 图12 所 示，TGFB 为MAPK 信 号 通 路 中的重要组成部分，是关键节点之一。转化生长因子β（TGF-β）/骨形态发生蛋白（BMP）信号传导参与绝大多数细胞过程，在整个生命过程中至关重要[33]。TGF-β/BMP 在哺乳动物发育过程中的骨形成中具有广泛的作用，并在体内发挥着多种调节功能。TGF-β/BMPs 的信号转导具体通过经典Smad 依赖途径和非经典Smad 独立信号途径（p38 丝裂原活化蛋白 激 酶 途 径，MAPK）[34]。Runx2 和TGF-β/BMP 激活的Smad 的协同活性对骨骼的形成至关重要。BMP（骨形态发生蛋白）为TGF-β 超家族中的重要成员。BMP 通过调节一系列下游基因的活性，参与调控中胚层形成、神经系统分化、牙齿和骨骼发育以及癌症发生等生物学过程。其中的BMP-2、4 均具有较强的成骨能力[35]。BMP 信号的传递主要通过配体BMP 与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体（BMP receptor，BMPR）特异性结合，形成配体受体二元复合物[36]。与此同时BMPR2 能够活化BMPR1，并将信号传送给细胞内的Smad 分子[37]。骨骼的形成也依赖于Runx2和BMP/TGF-β 激活的Smads 的协同活性。TGF-β/BMP2 信号通路、MAPK 依赖的磷酸化和Runx2 亚核靶向汇聚起来可诱导成骨表型[38]。Osterix 是一种属于特异性蛋白（Sp）家族在2002 年被发现的锌指转录因子。迄今为止，大量研究确定了Osx 在骨形成中的重要作用。如果成骨细胞特异性标记基因不能在Osx突变胚胎中表达，则不能形成骨[39-40]。综上故选取相关蛋白，作为桃红四物汤治疗股骨头坏死的实验验证。并在相关实验中，提示桃红四物汤有抗炎、促成骨分化，骨形成的相关作用。进一步为临床应用提供了实验验证证据。

图12 MAPK KEGG PATHWAY

结 论

本研究通过网络药理学，组建交互网络。结果表明，桃红四物汤具有多靶点治疗股骨头坏死的特性。此外，桃红四物汤对除股骨头坏死以外的疾病，如血脂异常、肝炎、肿瘤等还具有潜在的治疗潜力。这说明不同的疾病可以用相同的中药处方来治疗，符合了中医药的特点“异病同治”。综上，体现了中药复方中含有多靶点、药理作用广泛的特点[41-43]。本研究通过系统网络药理学初步确定了桃红四物汤的促进血液循环、抗炎、促进骨修复的作用。未来将补充分子对接，进一步阐释相关有效成分与相关靶点关系。本研究建立的药物-靶点-疾病网络，为临床治疗股骨头坏死提供了临床依据。