基于网络药理学联合转录组学研究大黄-天南星治疗缺血性脑卒中的分子生物学机制*

张晓璐，潘赐明，沈德连，段浩荣

1 广西壮族自治区江滨医院 广西南宁 530001

2 云南中医药大学 云南昆明 650500

急性缺血性脑卒中是临床常见的危急病之一，救治不及时则严重危害患者生活质量，甚至丧失生命；中医在《黄帝内经》就有相关记载，譬如《灵枢·九宫八风》[1]载：“其有三虚而偏中于邪风，则为击仆偏枯矣”。秦汉时中风的病因主要为外邪入侵、脏腑经络气血虚衰、气机乖戾、摄饮不当等[2]。汉·华佗首次明确提出中风运用下法，如《中藏经·论治中风偏枯之法》载：“人病中风偏枯……在中则泻之……泻，谓通其塞也”[3]。《金匮要略·中风历节病脉证并治》中用风引汤“除热瘫痫”，暗含了下法治疗“瘫”的思想[4]。同时方中将大黄作为首药，后世医家不断完善，在金元时期得到发展，及至明清下法在治疗中风达到了成熟与顶峰[5]。

基于数据挖掘结果显示，大黄、胆南星为治疗中风的常用高频次药物[6-7]。系统聚类结果显示，大黄、胆南星为治疗卒中的常见组合，关联规则分析胆南星-大黄的支持度高达72.88%，两者相须为用，通腑涤痰[8-9]。有鉴于此，本研究利用生物信息技术，建立大黄-天南星药对与缺血性脑卒中靶点治疗网络，预测大黄-天南星药对有效成分治疗缺血性脑卒中的作用机制。

方 法

1 化学成分筛选活性成分靶点预测

采用TCMSP 数据库，分别检索大黄、天南星的化学成分，将筛选条件限定为口服利用度OB ≥28%，创建txt 文档，将符合条件的有效成分下载备用。

将候选活性成分导入TCMSP 平台、ETCM 数据库（http： //www.nrc.ac.cn： 9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）[10]及SymMap 数 据 库（http：//www.symmap.org/）[11]，查询候选化合物所有的潜在靶点。

2 网络构建和分析

通 过 检 索5 个 数 据 库（GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb）检索疾病相关基因，分别下载相关基因，再利用R 语言VennDiagram 数据包得出大黄-天南星药对潜在靶点和缺血性脑卒中相关靶点交集，最终将交集核心靶点构建PPI 网络[12]。

3 GO 及KEGG 富集分析

将关键共有靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，最终使用R 软件绘制GO 功能富集分析气泡图、KEGG气泡图以及通路图[13]。

4 核心靶点的微阵列芯片验证

为检验核心靶点的可靠性，以“stroke”为关键词，检索美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GEO 数据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），筛 选stroke相关的微阵列芯片数据集。通过GEOquery 包从GEO数据库中下载，去除掉一个探针对应多个分子的探针，当遇到对应同一个分子的探针时，仅保留信号值最大的探针，然后通过箱式图查看样本标准化的情况，通过PCA 图以及UMAP 图查看样本分组间聚类情况接着利用limma 包进行两组的差异分析，具体差异分析的情况见「结果情况」的差异分析。

结 果

1 活性化合物筛选

对大黄-天南星药对在TCMSP 数据库搜索化合物，按照OB ≥28%且DL ≥0.18 的标准筛选出共22个活性化合，其中大黄15、天南星7，见表1。

表1 活性药物成分

2 疾病相关基因获取

通过检索5 个数据库，即GeneCards（5545 个）、Drugbank（28 个）、PharmGkb（1 个）、TTD（34 个）、OMIM（个）数据库检索疾病相关基因，见图1。

图1 疾病相关基因合并图

3 大黄-天南星药对防治卒中靶点韦恩图

利用R 语言VennDiagram 数据包得出大黄-天南星药对潜在靶点和卒中相关靶点交集，共发现37 个 共 同 基 因，KCNH2、PTGS2、PGR、PTGS1、HSP90AA1、DRD1、CHRM1、SCN5A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、ADRB2、CHRNA2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、NR3C2、ADH1C、RXRA、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。确定为大黄-天南星药对治疗卒中的靶基因，结果见图2。将共有靶点输入String 数据库，选择置信度≥0.40 作为筛选的标准以构建药物与疾病蛋白相互关系网络图PPI 网络，颜色越深，节点越大，表示该靶点与药物和疾病的相关性越强。线条越多表示之间的关联度越大，见图3。使用R 软件查找PPI 网络核心靶点，其中CASP9、CASP3 和CASP8 靶标体现出较高的中心度。

图2 核心靶点筛选韦恩图

图3 核心靶点蛋白质—蛋白质相互作用网络图

4 大黄-天南星药对靶点与卒中相互作用网络

将大黄-天南星药对的候选化学成分与缺血性脑卒中基因靶点通过Cytoscape 3.7.1 建立大黄-天南星药对成分靶点-缺血性脑卒中靶点群网络，青色三角形代表中药潜在活性成分，外边蓝色菱形代表潜在的作用靶点，两者的相互关系如图所示，见图4。

图4 活性成分-靶点蛋白网络图

5 大黄-天南星药对治疗缺血性脑卒中的GO 功能与KEGG 富集分析

对3 个核心靶点进行GO 功能富集分析，选取最具有统计学意义的前30 条，结果见气泡图，图5。富集结果显示：①在BP 中主要涉及膜电位的调节（regulation of membrane potential）、腺苷酸环化酶调节G蛋白偶联受体信号通路（adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway）、G 蛋白偶联的受体信号通路，与神经递质水平的环状核苷酸第二信使调节相结合（G protein-coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger regulation of neurotransmitter levels）等；②在CC 中靶点涉及膜区（membrane region）；③在MF中靶点相关分子功能主要包括G 蛋白偶联的胺受体活性（G protein-coupled amine receptor activity）、神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、突触后神经递质受体活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）等。

图5 GO 富集气泡图

KEGG 富集结果提示大黄- 天南星药对干预缺血性脑卒中主要涉及神经活性配体- 受体相互作 用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、神 经变性的途径- 多种疾病钙信号传导途径（Pathways of neurodegeneration - multiple diseases Calcium signaling pathway）、血清素能突触（Serotonergic synapse）、心肌细胞的肾上腺素信号传导（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、人类免疫缺陷病毒1 感染（Human immunodeficiency virus 1 infection）、帕 金森综合征（Parkinson disease）等；见图6。

图6 KEGG 富集气泡图

6 核心靶点微阵列芯片验证结果

最终选定微阵列芯片数据集GSE97537。该数据集基于GPL1355[Rat230_2]Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array 阵列平台，包括7 例脑卒中RNA 样本和5 例正常RNA 样本。由PCA 图-样本聚类情况可见（图7），基因表达谱区分度良好，保证了后续差异表达分析的准确性。过滤后的分子总数为14378 个，其中满足|log2（FC）|＞1 & p.adj＜0.05 阈值的ID 有223个，在这阈值下，在实验组（分组2）中高表达（logFC为正）的数目有215 个，在参考组（分组1）中高表达（logFC 为负）的数目有8 个；满足|log2（FC）|＞1.5 &p.adj＜0.05 阈值的ID 有79 个，在这阈值下，在实验组（分组2）中高表达（logFC 为正）的数目有79 个，在参考组（分组1）中高表达（logFC 为负）的数目有0 个；满足|log2（FC）|＞2 & p.adj＜0.05 阈值的ID 有34 个，在这阈值下，在实验组（分组2）中高表达（logFC 为正）的数目有34 个，在参考组（分组1）中高表达（logFC为负）的数目有0 个；如图8 所示，样本分开并且PC1和PC2 的比例高，说明分组间差异明显，后续差异分析有意义的结果可能会比较多；经典差异分析-火山图，当前阈值为|logFC|＞1 & 图中P值＜0.05，见图9。DEGs 与核心靶点取交集后得到3 个交集基因CASP3、CASP9 和CASP8，证明了上述分析的可靠性。

图7 脑卒中数据集主成分分析

图8 脑卒中样本DEGs 火山图

图9 GSE97537 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8表达量柱状图

7 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8 表达量分析

首先，我们对微阵列芯片数据集GSE97537 中交集基因的达量进行了统计分析，如图9 所示；从统计描述表中可以看到：在Casp3 组中，实验组的平均水平为（9.067±0.475）对照组的平均水平为（8.087±0.028）；在Casp9 组中，实验组的平均水平为（7.887±0），对照组的平均水平为（7.888±0）；在Casp8 组中，实验组的平均水平为（6.764±0.102），对照组的平均水平为（6.53±0.068）；独立样本T 检验结果显示：在Casp3 组中，对照组低于实验组的平均水平，两组的差值为-0.98（-1.46 ～-0.499），差异具有统计学意义（t= -4.540，P= 0.001）；在Casp9 组中，对照组低于实验组的平均水平，两组的差值为0（-0），差异具有统计学意义（t= 4.857，P= 0.001）；在Casp8 组中，对照组低于实验组的平均水平，两组的差值为-0.234（-0.351 ～-0.116），差异具有统计学意义（t= -4.431，P= 0.001）。

讨 论

近15 年我国缺血性脑卒中患者由1044/10 万上升至1256/10 万，现患人数高居世界首位，而且具有高发病率、高复发率、高致残率和高病死率的特点[14]。中风发作期多见实证，其中痰、瘀是主要病理因素[15-16]。因此在发作期治疗则急则治标，《金匮要略》[17]“夫病痼疾加以卒病，当先治其卒病，后乃治其痼疾也”。金元时期强调中风“内伤”学说，强度火、虚、痰等致病因素[18]。朱丹溪特别重视痰邪这一致病因素，如《丹溪心法·中风》[19]载：“中风大率主血虚有痰，治痰为先”。力倡治痰在中风病治法中的指导作用[20]。笔者认为，中风可以是由郁到痰瘀的过程，先有无形之郁，此时气机阻止，久则有形之邪内生，痰瘀则为代表。黄元御从“土湿阳衰，木郁侮土”立论治疗中风，着重调整脏腑气机[21]。临床所见，闭证多而脱证少，初起即出现脱证者更少[22]。对于发作期患者，标实是当务之急，因此，通腑法作为中风病急性期的常用治法受到临床普遍重视和广泛应用[23]。中风治法中通、调最为关键，其次补之[24]。

通腑泻浊法能够减轻痰瘀、增强胃肠蠕动，调节脑肠肺轴功能，进一步减轻中枢神经系统损伤，改善患者神经功能缺损[25]。生大黄逐瘀通经、泻热通肠，《神农本草经》载：“味苦，寒。主下淤血，血闭，寒热，破癥瘕积聚，留饮，宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”[26]。通过内服、保留灌肠均具有较好的临床疗效[27-28]。大黄提取物通过降低炎症水平，进一步抑制缺血侧脑细胞凋亡，最终发挥脑保护作用[29]。大黄的作用机制已经得到了实验验证。胆南星祛风化痰，李中梓的《雷公炮制药性解》载：“味苦、辛，性平，有毒，入脾、肺二经。主中风牙关紧闭，痰盛麻痹，下气破坚积，消痈肿，利胸膈，散血堕胎，捣敷疥癣疮毒并蛇虫咬伤。沸水泡七次，以牛胆汁收其末入胆，久悬风处更佳”[30]。缺血性中风痰瘀阻络则贯穿本病始终，故治疗清热祛痰为着力点，胆南星清热化痰以通腑，能够快速减轻病症，防治继续发展[31]。胆南星为天南星炮制品，专主风痰，清火化痰作用较强[32]。大黄成分类型和药理作用主要有蒽醌类：抗病毒；蒽酮类：抗氧化、抗炎和调节机体免疫等；吡喃酮类：抗氧化；二苯乙烯类：清除自由基、抗衰老等；本丁酮类：抗炎镇痛；酰基糖苷类：促进细胞免疫；萘苷类：雌激素样作用。胆南星成分类型和药理作用主要有发挥性物质：抗菌、抗病毒等；胆汁酸类：解热、抗菌、抗炎及抗病毒等[33]。本研究发现治疗缺血性脑卒中的大黄-天南星药对活性成份主要有大黄素、β-谷固醇、谷甾醇、托拉内酯、大黄酸等，大黄素和大黄酸具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等生物活性，同时能够增加斑块的稳定性[34]。

PPI 网络表明，靶标体现出较高的中心度有CASP9、CASP3 和CASP8；同时这三个基因是GEO数据库中转录组学微阵列芯片数据集GSE97537 中交集基因，微阵列芯片数据集GSE97537 同步验证了CASP9、CASP3 和CASP8 在脑卒中组和健康组的表达量对比有差异。

CASP3 基因编码的蛋白质是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用。编码的蛋白质在裂解和激活甾醇调节元件结合蛋白以及半胱天冬酶6，7 和9 的同时，裂解和失活聚（adp -核糖）聚合酶。这种蛋白质本身由caspase 8，9和10 处理。它是参与淀粉样β 4A 前体蛋白裂解的主要半胱天冬酶，该蛋白神经元死亡有关。

CASP9 和CASP8 基因编码半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成员。连续激活的caspases在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用。半胱天冬蛋白酶作为非活性的前酶存在，在保守的天冬氨酸残基上经过蛋白质水解过程产生大大小小的两个亚基，它们二聚形成活性酶。CASP9 蛋白可经过细胞色素c和凋亡肽酶激活因子1 的蛋白复合物凋亡小体的自蛋白水解处理和激活；这一步被认为是caspase 激活级联中最早的一步。这种蛋白质被认为在细胞凋亡和肿瘤抑制中起着重要作用CASP8 蛋白参与Fas 和各种凋亡刺激引起的程序性细胞死亡。该蛋白的n端类FADD 死亡效应域提示其可能与fas 相互作用蛋白FADD 相互作用。这种蛋白质在亨廷顿病患者受影响的脑区不溶性部分中被检测到，但在正常对照组中没有检测到，这暗示了它在神经退行性疾病中的作用。CASP 参与细胞凋亡，是调节细胞凋亡的中心环节[35]。

CASP3 在小胶质细胞中表达活跃，而活跃的CASP3 表达仅限于Ⅱ/Ⅲ层，CASP3 被认为在发育过程中参与神经元凋亡，被认为是脑缺血、创伤性脑损伤、脊髓损伤和脑出血后细胞死亡的关键介导因子，CASP3 也被证明在细胞增殖和分化中发挥非凋亡作用[36]。CASP3 在脑卒中恢复过程中的非凋亡作用。一项研究显示，由缺血脑培养的新生神经元前体细胞表达的裂解CASP3 抑制了其自我更新；同时神经原性小龛中局部上调裂解CASP3 对新生神经元前体细胞的增殖、迁移和成熟非常重要，抑制CASP3 活性可以改善脑卒中后的功能恢复[37]。CASP9 是caspase 蛋白酶家族的一员，是caspase 蛋白酶凋亡的启动者，是脑缺血神经退行性变的调节因子，也是促进脑卒中细胞死亡CASP6 激活的早期中介因子[38]。

CASP8 在大多数皮质神经元中均可检测到组成性表达，CASP8 表达主要在V 层，且早在永久性大脑中动脉闭塞致大鼠局灶性卒中后6h，就发现蛋白水解过程产生活性形式的CASP8[39]。在人缺血性中风受试者死后组织中的小胶质细胞/巨噬细胞中激活CASP8 和CASP3，CASP8 激活后裂解下游的caspase并导致细胞凋亡[40]。

综上，本研究运用网络药理学和GEO 数据库转录学验证的方法分析了大黄-天南星治疗缺血性脑卒中的作用机制，得出的结论是：大黄-天南星对药可能是通过抑制CASP3，CASP8 和CASP9 通路进而抑制细胞凋亡而发挥治疗缺血性脑卒中作用。