基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA检测牛奶中的E. coli O157:H7

曹文凯山 珊刘道峰彭 娟邢克宇赖卫华

(1. 南昌大学食品学院,江西 南昌 330047;2. 江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330022;3. 江西省疾病预防控制中心,江西 南昌 330029;4. 江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室,江西 南昌 330029;5. 长沙理工大学食品科学与生物工程学院,湖南 长沙 410114)

E.coliO157:H7是一种常见食源性致病菌,它可以通过被污染的食物来传染人类,如未煮熟的肉制品、生牛奶等[1]。感染E.coliO157:H7后可能会出现腹痛和腹泻等症状,严重时会导致肾衰竭甚至死亡。

目前,用于检测食源性致病菌的方法(例如,平板培养、菌落计数法、Lamp和PCR等),存在既费力又费时的问题。近年来,研究者已经开发了多种快速、灵敏和可靠的方法来检测E.coliO157:H7。免疫分析技术如酶联免疫吸附[9]、化学发光免疫分析[10]和免疫层析等具有快速、灵敏度高和特异强等优势,在食源性致病菌检测中发挥着重要作用。其中酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种基于抗原和抗体特异性反应的分析技术,现已被广泛地应用于E.coliO157:H7的快速检测。在传统的ELISA中,通常采用辣根过氧化物酶催化显色底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)作为信号输出,存在灵敏度相对较低的问题,严重妨碍了ELISA在实际检测中的应用。高信号的荧光与ELISA结合起来,可以解决ELISA灵敏度较低的问题。

铜纳米团簇(Copper nanocluster,CuNCs)因其独特的超小尺寸和较宽的斯托克斯位移,与传统荧光探针相比,具有更优越的荧光特性,在生物传感和生物示踪等领域具有广阔的应用前景。其中以腺嘌呤—胸腺嘧啶双链DNA(Adenine-thymine double stranded DNA,AT dsDNA)为模板合成的CuNCs,具有合成简单、荧光强度高和尺寸可调等优势。在抗坏血酸的作用下Cu2+会在AT dsDNA模板上被还原成Cu0+形成CuNCs,在特定的激发波长下,能够产生稳定的荧光信号[16]。而焦磷酸盐(Pyrophosphate,PPi)对Cu2+的强配位作用将抑制Cu2+的还原,从而抑制荧光信号的产生。PPi是公认的碱性磷酸酶的天然底物,当其被碱性磷酸酶水解成磷酸盐(Phosphate,Pi)后,Cu2+会从PPi-Cu2+-PPi配位复合物中释放出来,被抗坏血酸在模板DNA上还原成Cu0+[19],形成CuNCs。

研究拟通过碱性磷酸酶水解PPi释放Cu2+,在抗坏血酸的作用下Cu2+在AT dsDNA模板上被还原成Cu0+,形成CuNCs。以具有较强荧光信号的CuNCs作为荧光信号探针,建立一种新型的荧光ELISA,用于检测低脂牛奶和脱脂牛奶样本中的E.coliO157:H7。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

低脂牛奶、脱脂牛奶:市售;

含20,30,40,50,60,70个碱基的AT dsDNA(AT20、AT30、AT40、AT50、AT60和AT70):生工生物工程股份有限公司;

焦磷酸盐(Pyrophosphate,PPi)、CuSO4·5H2O和抗坏血酸(Ascorbic acid):分析纯,阿拉丁生物试剂股份有限公司;

牛血清白蛋白(BSA):纯度≥98%,美国Sigma-Aldrich公司;

3-吗啉丙磺酸(MOPS)、PBS、(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)TMB显色液和碱性磷酸酶:阿拉丁生物试剂股份有限公司;

其他试剂:分析纯,市售;

E.coliO157:H7鼠源单抗(Monoclonal antibody,mAb)、E.coliO157:H7兔源多抗(Polyclonal antibody,pAb)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(HRP-IgG)和碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(ALP-IgG):迈迪胺生物科技有限公司;

黑色96孔酶标板:康宁有限公司;

菌种:大肠杆菌 O157:H7(ATCC 43888)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 18S51)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC 10708)、鸭沙门氏菌(ATCC 9270)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、单核增生李斯特菌(ATCC 13932)、蜡样芽孢杆菌(CICC 21493)、福氏志贺氏菌(CMCC 2457)、大肠杆菌 O157:H7 (SR0981D)、大肠杆菌(ATCC 25922):江西省疾病预防控制中心。

1.2 主要仪器

酶标仪:SpectraMax i3x型,美谷分子仪器(上海)有限公司;

透射电镜:JEM 2100 F型,捷欧路(北京)科贸有限公司;

恒温培养箱:GZX-9246MBE型,上海福玛实验设备有限公司;

分析天平:FA1024型,梅特勒托利多科技(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPi-Cu2+-PPi复合物制备 将50 nmol的Cu2+和90 nmol的PPi加入到130 μL含有80 nmol的AT50的MOPS缓冲溶液(20 mmol/L,MOPS,pH 7.6)中混合均匀,室温下避光孵育30 min,得到PPi-Cu2+-PPi复合物。

1.3.2 荧光ELISA的操作步骤 用碳酸盐缓冲液(0.2 mg/mL,pH 9.6)稀释的pAb(10 μg/mL,100 μL)作为捕获抗体包被酶标板,在4 ℃条件下过夜包被,用PBST(按0.05 mL/100 mL将吐温20加入到0.02 mg/mL的1×PBS中)洗板4次后拍干,然后加入230 μL的封闭剂(3 mg/100 mL BSA),在恒温培养箱中37 ℃条件下封闭2 h,用PBST洗板后备用。

检测时将100 μL的E.coliO157:H7菌液加入酶标板,并设置阴性对照(1×PBS,100 μL),在37 ℃条件下孵育1 h后用PBST洗板;然后将mAb(10 μg/mL,100 μL)作为检测抗体加入酶标板,在37 ℃条件下孵育30 min后用PBST洗板;将酶标二抗ALP-IgG(3万倍稀释,100 μL)加入酶标板,在37 ℃条件下孵育30 min后用PBST洗板;再加入190 μL的PPi-Cu2+-PPi复合物,37 ℃条件下孵育60 min,最后加入10 μL,10 mmol/L的抗坏血酸用酶标仪读取在365 nm激发下610 nm处的荧光值。

1.3.3 关键参数优化 试验参数:Cu2+浓度、PPi浓度、DNA模板浓度、DNA模板长度和抗坏血酸浓度,采用单一变量的原则,对各个参数进行优化。除1.3.3(1)外均在1×106CFU/mL的E.coliO157:H7、1 μg的mAb、1 μg的pAb和3万稀释的ALP-IgG情况下进行。

(1) Cu2+浓度优化:由于Cu2+是影响PPi-Cu2+-PPi复合物以及产生CuNCs的关键因素,因此在缓冲溶液(1×PBS,pH 7.6)中对其浓度进行优化。在20 μL的AT40(1 mmol/L)、20 μL不同浓度的Cu2+(1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mmol/L)、20 μL的PPi(5 mmol/L)和10 μL的抗坏血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS体系下,37 ℃反应30 min,考察不同浓度Cu2+所形成的PPi-Cu2+-PPi复合物对荧光强度的影响。

(2) PPi浓度的优化:在20 μL的AT40(1 mmol/L),20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL不同浓度的PPi(3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 mmol/L)和10 μL的抗坏血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS体系下,37 ℃反应30 min,通过信噪比F/F0(F:阳性荧光信号值,F0:阴性荧光信号值)来考察不同浓度PPi所形成的PPi-Cu2+-PPi复合物对荧光强度的影响。

(3) DNA模板长度的优化:在20 μL 4 mmol/L不同长度的DNA模板(AT20、AT30、AT40、AT50、AT60)、20 μL 的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL的抗坏血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS体系下,37 ℃反应30 min,通过信噪比F/F0考察DNA模板长度对荧光强度的影响。

(4) DNA模板浓度的优化:在20 μL不同浓度的AT50(0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 mmol/L)、20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL的抗坏血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS体系下,37 ℃反应30 min,通过信噪比F/F0考察DNA模板浓度对荧光强度的影响。

(5) 抗坏血酸浓度的优化:在20 μL的AT50(4 mmol/L)、20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL不同浓度的抗坏血酸(6,8,10,12,14 mmol/L)以及130 μL的MOPS体系下,37 ℃反应30 min,通过信噪比F/F0考察抗坏血酸浓度对荧光强度的影响。

1.3.4 荧光ELISA检测E.coliO157:H7 在1.2.3的最优条件下,将100 μL不同稀释倍数下的E.coliO157:H7(菌数为1×102,5×102,1×103,5×103,1×104,5×104,1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108CFU/mL),使用酶标仪测量荧光,激发波长365 nm,发射波长610 nm。

1.3.5 传统显色ELISA检测E.coliO157:H7 ELISA步骤同1.3.2。加入mAb孵育并洗板后,将3 000倍稀释的HRP-IgG,加入酶标孔孵育30 min并洗板后,加入100 μL的TMB显色液,反应15 min后加入200 nmol的H2SO4终止液,用酶标仪读取450 nm处的OD值。

1.3.6 荧光ELISA的特性鉴定

(2) 特异性:通过交叉反应试验鉴定检测方法的特异性。利用荧光ELISA法分别检测E.coliO157:H7与相同浓度的其他菌种:大肠杆菌 O157:H7 (SR0981D)、大肠杆菌(ATCC 25922)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 18S51)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC 10708)、鸭沙门氏菌(ATCC 9270)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、单核增生李斯特菌(ATCC 13932)、蜡样芽孢杆菌(CICC 21493)和福氏志贺氏菌(CMCC 2457)的荧光值对比来评估检测E.coliO157:H7的特异性。

1.3.7 精密度和准确度 在两种不同的牛奶样本中添加,低中高3种倍数稀释的E.coliO157:H7,每个水平的添加样品利用荧光ELISA法重复检测3次,通过计算添加E.coliO157:H7的平均回收率和变异系数(CV)来鉴定方法的精密度和准确度。

2 结果与分析

2.1 荧光ELISA检测E. coli O157:H7的原理

试验方法的检测原理如图1所示。当不存在目标菌E.coliO157:H7时,在ELISA孔中不会形成双抗夹心结构,IgG-ALP不会结合在ELISA孔中,因此PPi-Cu2+-PPi复合物不会被水解,并阻止抗坏血酸将Cu2+在dsDNA链上还原成Cu0+形成CuNCs。当存在目标菌E.coliO157:H7时,IgG-ALP会通过双抗夹心结构结合到ELISA孔中来水解PPi-Cu2+-PPi复合物,释放出的Cu2+会被抗坏血酸在dsDNA上还原成Cu0+形成CuNCs,产生荧光信号。试验通过测定荧光强度的变化来判断PPi-Cu2+-PPi是否会水解并产生荧光信号,设计了一种荧光ELISA来检测E.coliO157:H7。

图1 基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA 检测E. coli O157:H7原理

2.2 用ALP水解PPi恢复CuNCs用于检测的可行性分析

为了检验该ELISA用于检测E.coliO157:H7的可行性,即ALP能否催化水解PPi并恢复CuNCs荧光,测定了ALP存在与不存在时的荧光值。如图2(a)所示,当在PPi-Cu2+-PPi复合体系中存在ALP(2 μL,10 U)时,会产生较强的荧光信号,如图2(b)所示,形成的CuNCs的粒径为5 nm。当不存在ALP时,几乎没有荧光信号,以上结果表明,PPi的存在会阻碍CuNCs荧光的形成,并且通过ALP来水解PPi恢复CuNCs荧光用于检测E.coliO157:H7是可行的。

图2 存在ALP和不存在ALP时的荧光强度和投射电镜图

2.3 试验条件优化

2.3.1 Cu2+浓度优化 根据检测原理,Cu2+是桥接ELISA以及CuNCs荧光信号形成的关键因素。因此,在缓冲溶液中,考察了Cu2+对CuNCs荧光信号的影响。如图3所示,不存在PPi时,荧光信号会随着Cu2+浓度的增加而升高,当Cu2+浓度达到3.5 mmol/L时,荧光信号达到最高,当Cu2+浓度达到4 mmol/L时,荧光强度降低,可能是由于高浓度的Cu2+在抗坏血酸的作用下,会生成氧自由基来降解dsDNA模板,导致荧光强度降低。存在PPi时,随着Cu2+浓度的增加,荧光信号随之升高的原因是尽管一部分的Cu2+会与PPi配位形成PPi-Cu2+-PPi复合物,但是过剩的Cu2+仍会被抗坏血酸还原,形成CuNCs。结果表明,Cu2+的最佳浓度为2.5 mmol/L。

图3 Cu2+浓度的优化

2.3.2 PPi浓度的优化 如图4所示,随着PPi浓度的增加,F/F0逐渐增加,当PPi浓度达到4.5 mmol/L时,F/F0达到最大值,当PPi浓度>4.5 mmol/L时,F/F0开始降低,可能是由于高浓度的PPi不能完全被ALP所水解,过剩的PPi通过强配位作用结合Cu2+,抑制CuNCs荧光的产生。因此,PPi的最佳浓度为4.5 mmol/L。

图4 PPi浓度优化

2.3.3 DNA模板长度优化 如图5(a)所示,随着dsDNA长度的增加,F/F0逐渐增加,当dsDNA长度达到50 bp时,F/F0达到最大值,之后F/F0不再发生明显变化。因此,dsDNA的最佳长度为AT50。

图5 dsDNA长度和浓度的优化

2.3.4 DNA模板浓度优化 如图5(b)所示,随着AT50浓度的增加,F/F0逐渐增加,当dsDNA浓度达到4 mmol/L时,F/F0达到最大值,之后F/F0不再发生明显变化。因此,AT50的最佳浓度为4 mmol/L。

2.3.5 抗坏血酸浓度优化 如图6所示,随着抗坏血酸浓度的增加,F/F0逐渐增加,当抗坏血酸浓度达到10 mmol/L时,F/F0达到最大值,之后F/F0开始降低,可能是高浓度的还原剂会抑制CuNCs荧光。因此,抗坏血酸的最佳浓度为10 mmol/L。

图6 抗坏血酸浓度优化

2.4 检测方法的性能

2.4.1 灵敏度鉴定 稀释菌数为1×102,5×102,1×103,5×103,1×104,5×104,1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108CFU/mL的E.coliO157:H7,经荧光ELISA检测后,以E.coliO157:H7菌数为横坐标,检测所得的荧光强度值为纵坐标,绘制的标准校准曲线如图7所示,曲线的线性范围为5×104～1×108CFU/mL,线性回归方程为y= 2.1×107lg(x)-9×107,R2=0.980 8,最低检出限为2.4×104CFU/mL。如图8所示,普通的HRP催化TMB显色ELISA的线性范围为5×105～5×107CFU/mL,线性回归方程为y=0.41 lg(x)-1.16,R2=0.983 4,LOD为3.36×105CFU/mL。相比而言,研究开发的荧光ELISA比传统ELISA灵敏14倍,且检测线性范围更宽。

图7 E. coli O157:H7定量分析荧光ELISA标准校准曲线

图8 基于HRP的传统E. coli O157:H7定量分析ELISA标准曲线

2.4.2 特异性鉴定 利用荧光ELISA法检测菌数为5×106CFU/mL的E.coliO157:H7和其他菌株。以所测定的荧光值作为评判该方法特异性的标准。如图9所示,只有E.coliO157:H7存在时,才会恢复CuNCs荧光,产生较高的荧光信号值。由于方法建立所使用的捕获抗体的特异性较好,因此能够对单一菌株识别捕获,使检测方法显示出良好的特异性。

图9 荧光ELISA的特异性

2.4.3 实际样本分析 为探讨该方法检测食品中E.coliO157:H7的可行性,在两种牛奶样品中加入E.coliO157:H7进行分析,采用外标法评价了该方法的可行性。结果见表1。牛奶样品中,3个加标水平的平均回收率在92.2%～108.5%,相对标准偏差4.9%～10.4%,表明该检测方法准确性较好,可用于实际样品检测。

表1 实际样本中E. coli O157:H7的加标回收率

3 结论

试验利用Cu2+与焦磷酸盐的强配位原理,设计了一种基于碱性磷酸酶水解焦磷酸盐释放Cu2+形成铜纳米团簇的荧光酶联免疫吸附技术,用于低脂和脱脂牛奶样本中E.coliO157:H7的检测。在最佳条件下,E.coliO157:H7的菌数与荧光信号值在5×104～1×108CFU/mL范围内呈良好的线性关系,最低检测限为2.4×104CFU/mL比传统显色酶联免疫吸附技术灵敏14倍,且检测线性范围更宽。该方法特异性好、灵敏度高,在低脂和脱脂牛奶样本中回收率理想(92.2%～108.5%),适用于E.coliO157:H7或其他病原微生物的灵敏检测。