油茶炭疽病发生与丛枝菌根真菌(AMF)关系研究

杨娅琳,武自强,刘 丽,张东华,马焕成,伍建榕

(1.西南林业大学 生物多样性保护学院 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,昆明 650224;2.西南林业大学 林学院 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室,昆明 650224)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是中国特有的木本油料植物,属山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)常绿小乔木或灌木,为木本油料植物[1-2]。在山地上种植,可以绿化荒山,提高森林覆盖率,保持水土,提高土壤肥力。发展油茶产业不仅是推动绿色发展的重要推手,也是保障国家粮油安全、助力国民健康长寿的绿色产业[3-4]。2020—2021年在云南省德宏傣族景颇族自治州大面积油茶种植基地调查发现,当地由于长期集约化种植、品种单一和不良环境条件的影响,炭疽病发生严重,致油茶落叶和落果,农民经济损失惨重。

丛枝菌根真菌(AMF)菌丝可侵染绝大多数陆生植物的根系,通过产生丛枝和泡囊连接植物根系与AMF,形成基于双向养分交换的共生关系[5-6]。大量研究表明,AMF能够促进植物生长,改善植物品质,增强植物对病虫害和非生物因素胁迫的抵抗等[8-9]。张钰等[10]发现接种AMF异形根孢囊霉Rhizophagusirregularis能增强杨树抗溃疡病的能力;高岩等[11]发现接种AMF能显著降低鸡蛋花干腐病的发病率和感病指数;刘芳洁[12]发现接种AMF可以提高紫苏对根腐病的抗性等。AMF可通过竞争减少病原菌的侵染位点,显著降低死株率、发病率和病情指数[13]。机理研究表明,AMF可以诱导植物迅速产生防御酶类,如过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等。此外,AMF定殖能够诱导植株合成内源信号物质,如生长素、赤霉素、水杨酸、茉莉酸等,激活植物防御体系,从而提高其抗病性[14]。

油茶感染炭疽病后,其根际土壤 AMF 群落如何发生变化尚不清楚。本研究以德宏州不同样地健康植株、发病植株根系和根区土壤为研究材料,依孢子形态和分子特征[7]鉴定油茶根区土壤 AMF 的种类,并分析油茶根际土壤 AMF 群落组成、多样性及结构对炭疽病发病的影响,为后续应用 AMF 防控油茶炭疽病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样地概况

德宏州地处云南省西部边陲,位于北回归线以北,东经97°31′～98°43′,北纬23°50′～25°20′,属南亚热带季风气候,年降水量1 400～1 700 mm,年平均气温为18.4～20 ℃,干旱指数0.4～1.2,雨量充沛,年温差小,日温差大,霜期短。选择德宏州的中营村、翁冷村、平山村3个样地,土壤类型均为红壤(表1)。

表1 采样地基本情况

1.2 油茶发病率及病情指数的调查

2019和2020年7—9月,选择10年生的白花油茶,每个样点同一地块随机选取健康植株和发病植株各10株,每株油茶按照东南西北4个方向各抽查30片叶片。发病率=感病植株(或叶片)数/调查总植株(或叶片)×100%。病情分级标准如下:0级——植物叶片健康无病斑;Ⅰ级——病斑面积占总面积的0～25%;Ⅱ级——病斑面积占总面积的26%～50%;Ⅲ级——病斑面积占总面积的51%～75%;Ⅳ级——75%以上面积坏死。经课题组实验鉴定,本次油茶炭疽病的主要病原菌为暹罗炭疽菌Colletotrichumsiamense、喀斯特炭疽菌Colletotrichumkarstii和胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides等[15]。

1.3 样品采集及处理

分别选取健康和发病植株(叶部明显轮纹状病斑,果实病斑明显,有的植株甚至枯死)各10株。去除林下腐殖质即土壤表面的枯落物,采取5～30 cm土层的根际土壤1 kg左右装入自封袋中(各土样均为东西南北方向各取一部分,混匀)。采集对应植株带须根的根系,选取距离植物主干 50 cm的根系,东西南北方向各采集5～20 cm,再将根系放置于FAA溶液(福尔马林5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL,用时稀释1倍)中,贴好标签并带回实验室4 ℃保存,用于AMF侵染率的测定;土壤样品风干后保存,用于AMF分离鉴定[16]。

1.4 AMF分离鉴定

(1)形态学鉴定。称取20 g土壤样品,放置烧杯内用水浸泡过夜,采用湿筛沉淀法分离AMF孢子,将分离得到的孢子置于立体显微镜下观察并计数。将孢子置于光学显微镜下,采用伍建榕等[16]的方法观察孢子形态,进行形态学鉴定。

(2)分子鉴定。采用单孢子提取法,在体视镜下挑取单个完整饱满的AMF孢子,将孢子破壁后加入30 μL TE Buffer和20%螯合树脂(Chelex-100),沸水浴(95 ℃)10 min,冰浴10 min,10 000 r/min离心5 min,取15～20 μL上清液即DNA。参考龙良鲲等[17]和刘润进等[9]的方法进行PCR扩增(巢氏PCR)、电泳。PCR引物(表2)参考Maarte等[18],由上海生工生物工程有限公司合成,第一轮PCR反应体系50 μL:DNA模板4 μL,上下游引物各2.5 μL,2×TaqPCR Mix 16.2 μL,无菌水24.8 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循环30次;72 ℃再延伸10 min。将第一轮PCR反应产物稀释5倍后作为第二轮扩增模板,第二轮PCR反应体系50 μL:DNA模板2 μL,上下游引物各2.5 μL,2×TaqPCR Mix 20.2 μL,无菌水22.8 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,循环30次;72 ℃再延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送擎科生物科技有限公司测序。测序结果通过MAARJAM的Blast检索系统进行同源序列搜索。

表2 供试引物序列

1.5 AMF菌根定殖率检测

将浸泡在FAA溶液中的根段取出,用蒸馏水清洗4～5次,用苯胺蓝染色法对根系进行水浴解离、酸化、染色、脱色[9,19]。所有处理完成后,选取油茶根系的二级侧根,将每个根段裁切为1 cm左右的小段,保证选取的样本可以裁切30个根段即可。将已经处理完全的根段放置在显微镜下进行镜检,待观察到根段组织中的AMF结构时,拍照并计算其定殖率[20]。

菌根真菌定殖率=∑(0×根段数+10%×根段数+20%×根段数+……+100%×根段数)/观察总根段数

1.6 AMF多样性分析

物种丰富度(SR)指油茶根际土样中AMF孢子数量[21],并按Margalef丰富度指数[D=(S-1)/InN]来计算,Shannon-wiener多样性指数(H′)[22]按公式[H′=∑PiInPi(Pi=Ni/N)]来计算,式中Pi=Ni/N,Ni为种i的数量,N为土样中AMF孢子的总数。

1.7 数据处理

利用Excel 2003和SPSS 22.0等统计分析软件,对所有试验所得数据进行统计和分析。用SPSS 22.0软件进行两组t检验,以P<0.05表示差异程度,双变量相关分析发病率、病情指数和AMF之间的关系。利用MEGA6对目的序列与相关菌株序列进行分析并构建Neighbor-Joining发育树。

2 结果与分析

2.1 油茶炭疽病的发病率、病情指数、孢子密度和定殖率

3个样地的油茶分别形成了不同程度的菌根共生体(泡囊、菌丝和丛枝),见图1。对各个样地的AMF定殖率、孢子密度、发病率及病情指数进行调查,结果显示,中营村的健康植株和感病植株土壤样本的孢子密度分别为37.98个/g和18.09个/g,总定殖率分别为10.80%和7.28%,该样地的孢子密度和总定殖率最低。翁冷村的健康植株和感病植株土壤样本的孢子密度分别为82.28个/g和32.55个/g,总定殖率分别为23.29%和9.22%。平山村的健康植株和感病植株的孢子密度分别为80.01个/g和47.89个/g,总定殖率分别为25.08%和13.06%(表3)。3个样地健康植株和感病植株的土壤样品AMF孢子密度及总定殖率均有显著差异。孢子密度和菌根定殖率最低的样地,发病率和病情指数最高,分别是58.06%和43.53,孢子密度和定殖率最高的样地,发病率和病情指数最低,分别是39.40%和25.37。

(a)泡囊、菌丝;(b)丛枝。

表3 油茶炭疽病病害及根际AMF调查结果

2.2 AMF孢子分子鉴定结果

通过巢式PCR扩增出AMF相应的特异性DNA序列,PCR产物的DNA片段大小为750 bp(图2),符合AMF分子鉴定要求。基于目标区段构建油茶根际土壤AMF的系统发育树(图3),AM-1、AM-2、AM-3、AM-4、AM-5、AM-6、AM-8、AM-14、AM-15、AM-16、AM-18属于类球囊霉属Paraglomus,AM-9、AM-10、AM-11、AM-12、AM-17属于球囊霉科Glomeraceae,AM-7属于球囊霉属Glomus,AM-13属于无梗囊霉属Acaulospora。

图2 AMF孢子扩增目的片段电泳图

2.3 AMF孢子形态

通过分子鉴定结果,结合形态学特征将孢子鉴定到种,AM-1为Paraglomussp.1,AM-3、AM-4、AM-5、AM-6为Paraglomussp.2,AM-2、AM-8为隐类球囊霉Paraglomusoccultum,AM-14、AM-15、AM-16、AM-18为Paraglomussp.3,AM-9、AM-10为黄金球囊霉Glomusaureum,AM-11为黑球囊霉Glomusmelanosporum,AM-12、AM-17为缩球囊霉Glonusconstrictum,AM-7为幼套球囊霉Glonusetunicatum,AM-13为刺无梗囊霉Acaulosporaspinosa;从3个样地中通过形态鉴定分离出孢子9属24种(图4,表4),包括无梗囊霉属Acaulospora的4种,双型囊霉属Ambispora的1种,近明球囊霉属Claroideoglomus的1种,多样孢囊霉属Diversispora的1种,巨孢囊霉属Gigaspora的1种,球囊霉属Glomus的11种,根孢囊霉属Rhizophagus的2种,类球囊霉属Paraglomus的2种,盾巨孢囊霉属Scutellospora的1种。结合形态特征和分子生物学鉴定,本次鉴定孢子归属9属26种。在3个样地中,中营村健康油茶土样中共分离鉴定出孢子5属20种,炭疽病发病植株土样中共分离鉴定出孢子4属18种。翁冷村健康油茶土样中共分离鉴定出孢子7属21种,炭疽病发病植株土样中共分离鉴定出孢子7属19种。平山村健康油茶土样中共分离鉴定出孢子8属24种,炭疽病发病植株土样中共分离鉴定出孢子7属20种。

(a)细凹无梗囊霉;(b)瑞氏无梗囊霉;(c)刺无梗囊霉;(d)浅窝无梗囊霉;(e)芬兰双型囊霉;(f)近明球囊霉;(g)扭形多样孢囊霉;(h)易误巨孢囊霉;(i)缩球囊霉;(j)黄金球囊霉;(k)棒球囊霉;(l)弗墨球囊霉;(m)多梗球囊霉;(n)凹坑球囊霉;(o)网状球囊霉;(p)幼套球囊霉;(q)黑球囊霉;(r)大果球囊霉;(s)变形球囊霉;(t)隐类球囊霉;(u)P.sp.1.;(v)明根孢囊霉;(w)木薯根孢囊霉;(x)美丽盾巨孢囊霉。

表4 油茶根际AMF群落系统分类表

2.4 AMF丰富度和多样性

中营村样点健康植株土样与感病植株土样的物种丰富度最低,分别为0.84和0.68,翁冷村样点分别为1.39和1.21,平山村样点分别为1.39和1.21。3个样地的物种丰富度均无显著差异。中营村样点健康植株土样与感病植株土样的Shannon-winer多样性指数(H′)分别为0.97和0.96,翁冷村样点分别为1.32和1.25,平山村分别为1.40和1.21(表5),可以看出,油茶炭疽病在发病后,AMF孢子的Shannon-winer多样性指数(H′)均呈下降趋势,但差异不显著。同时发现,孢子丰富度越高,多样性指数也越高,反之则越小。

表5 油茶根际土壤丛枝菌根真菌物种丰度和多样性指数

2.5 相关性分析结果

AMF定殖率与病情指数呈现极显著的负相关关系(P<0.01),与发病率呈现极显著的负相关关系(P<0.01);孢子密度、物种丰富度与油茶炭疽病的发病率与病情指数呈现极显著的负相关关系(P<0.01);多样性指数与油茶炭疽病的发病率与病情指数呈现显著的负相关关系(P<0.05),即AMF菌根定殖率、孢子密度、丰富度、多样性指数越高,病情指数越小,发病率越低(表6)。

表6 发病率、病情指数与AMF各指标之间的相关性

3 讨论与结论

通过对发病程度不同的3块样地土壤样品采用湿筛沉淀法进行AMF孢子的分离,结合形态学和分子学对AMF孢子进行鉴定,共分离得到9属26种AMF孢子。其中球囊霉属Glomus所占比例最多,是土壤中的优势属,与相关报道[23-25]的研究结果一致。

研究发现油茶根系中AMF的定殖率与油茶炭疽病发病率和病情指数呈现显著负相关关系(P<0.01),说明AMF的定殖能在一定程度上减少油茶炭疽病的发生,能对植物病害的发展起到一定的抑制作用,这与李淑君等[26]、尼玛此姆等[20]的结果一致,Ding等[27]也表明AMF的定殖可以延缓野豌豆炭疽病的发生,降低植物的发病率和病情指数。研究还发现AMF的孢子密度与油茶炭疽病的发病率以及病情指数呈现显著负相关性(P<0.01),即孢子密度越大则病害发病率及病情指数越小。研究发现油茶感病后根区土壤内AMF的丰富度与多样性降低,且丰富度和多样性与发病率和病情指数有负显著相关性,即AMF孢子种类越丰富,则油茶炭疽病发病程度越低。相关研究也表明,增加AMF的孢子种类多样性,能降低植物的发病率,提高植物的抗病性[11]。

综上所述,AMF的孢子密度、定殖率及多样性均能够增强油茶的抗病能力。故油茶接种AMF可以有效地防治油茶炭疽病,具有较好的应用前景。AMF提高植物抗病性是一个复杂的作用过程,对植物、病原菌、土壤及AMF之间的相互作用机制有待进一步研究,才能充分发挥AMF的生防作用。