基于指纹图谱结合化学计量学评价栽培与野生五指毛桃质量*

杨小催，郭凯欣，李燕芳，唐 慧，张庆业，潘海华，郑丽思，柯雪红△

（1. 广东省清远市中医院，广东清远 511500； 2. 广州中医药大学，广东广州 510405； 3. 广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

五指毛桃为桑科植物裂掌榕Ficus simplicissimaLour. 的干燥根，有广东人参之美称，分布于广东、福建、广西等地。有五爪龙、土北芪、五指香等别名，为岭南地区少数民族特别是瑶族、壮族的常用药［1］，最早记载于《生草药性备要》，具有健脾补肺、行气利湿、舒筋活络之功效，主治脾虚浮肿、食少腹胀、肢倦无力、肺虚痰喘、带下、盗汗、水肿、风湿痹痛、产后无乳、跌打损伤等［2-3］。五指毛桃以五爪龙之称收载于我国1977 年版《中国药典（一部）》，是现行《中国药典》品种宫炎平片处方中包含的主要药材之一［4］，并收录于2013 年版《广西壮族自治区瑶药材质量标准（第一卷）》［5］。广东省清远市地处粤北山区，是我国瑶族一大聚居区。五指毛桃作为道地瑶药材被广泛研究与应用，其资源以野生为主，随着土地资源的减少和过度开采，导致五指毛桃的野生资源量下降，无法满足市场需求，故其栽培品逐渐增多［6］。目前，尚未见野生与栽培五指毛桃药材指纹图谱结合化学模式识别的研究，限制了五指毛桃的质量标准制订及开发应用。本研究中收集广东省清远市不同地区（连山、连南、英德、清城）的21批野生五指毛桃药材及市售不同品牌的10 批栽培五指毛桃药材，采用高效液相色谱（HPLC）法［7-8］构建指纹图谱并测定其中补骨脂素、芹菜素、5-甲氧基补骨脂素的含量，同时采用层次聚类分析（HCA）［9-10］、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）进行化学计量学评价，为五指毛桃药材的质量标准及开发应用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），包括Empower2 色谱工作站、Waters2996 二极管阵列检测器；XS105 DualRange 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；SK3310LHC 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率为180～350 W，频率为35/ 53 kHz）；Thermo Legend Micro 17R型离心机（德国Thermo公司）。

1.2 试药

补骨脂素对照品（批号为110739-201918，纯度为99.6%），芹菜素对照品（批号为111901-202004，纯度为99.4%），5-甲氧基补骨脂素对照品（批号为520036-201401，纯度为99.2%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；水为超纯水；五指毛桃药材经广州中医药大学第一临床医学院袁小红教授鉴定均为正品，其药材样品信息见表1。

表1 栽培与野生五指毛桃药材样品信息Tab.1 Sample information of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱（0～10 min 时5%A →10%A，10～50 min 时10%A →30%A，50～65 min 时30%A →45%A，65～85 min 时45%A →90%A，85～87 min 时90%A →5%A，87～92 min 时5%A）；流速：1.0 mL/ min；运行时间：92 min；检测波长：320 nm；柱温：30 ℃；进样量：20µL。

2.2 溶液制备

取补骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基补骨脂素对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含补骨脂素0.050 4 mg、芹菜素0.016 18 mg、5 - 甲氧基补骨脂素0.050 2 mg的混合对照品溶液。

取五指毛桃药材样品粉末0.2 g，精密称定，置5 mL容量瓶中，加3 mL 50%甲醇，静置4～5 h，超声（功率为350 W，频率为35 kHz）提取30 min，用50%甲醇定容至5 mL，离心（转速为13 000 r/min）10 min，取上清液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为S1）粉末适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。以13 号峰（补骨脂素）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别低于1%和2.6%（n= 6）；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）计算的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）粉末适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以13 号峰（补骨脂素）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别低于2.4%和3.0%；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）计算的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取样品（编号为S1）粉末适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以13 号峰（补骨脂素）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别低于1%和2.4%（n= 6），采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）计算的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。

2.4 五指毛桃指纹图谱建立

特征峰及主要色谱峰指认：通过对10 批栽培五指毛桃HPLC 色谱图的考察与比较，最终标定19 个共有峰，其峰面积占总峰面积的比例超过90%。与对照品比对，可指认3 个色谱峰，其中13 号峰、15 号峰、16 号峰分别为补骨脂素、芹菜素和5-甲氧基补骨脂素，对应保留时间分别为43.16，48.25，52.84 min。详见图1。其中，13 号峰（补骨脂素）未与其他峰重叠，即分离度较好，峰强度较其他峰高，故以此峰作为参照峰。

图1 五指毛桃供试品溶液与混合对照品溶液高效液相色谱图13.Psoralen 15.Apigenin 16.5-MethoxypsoralenA.Test solution of Cultivate Fici Simplicissimae Radix B.Test solution of Wild Fici Simplicissimae Radix C.Mixed reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the test solution and mixed reference solution of Fici Simplicissimae Radix

HPLC 指纹图谱对比：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）计算的相似度均大于0.99，对10 批栽培五指毛桃药材样品的数据进行分析。采用多点校正后进行自动匹配，以10 批栽培五指毛桃药材样品均数为共有模式，建立10 批栽培五指毛桃与21 批五指毛桃对照图谱。对照图谱中有3 个特征峰群，1～12 号为特征峰群A，保留时间在0～37 min，其中，1～4 号峰峰面积逐渐增大，5～12 号峰峰面积较小且大小接近，12 个峰占总色谱峰峰面积的12%；13～16 号为特征峰群B，保留时间在43～54 min，13号峰较大，14～16号峰逐渐增大，4 个峰占色谱峰峰面积的75%；17～19 号为特征峰群C，保留时间在69～78 min，且3 个峰的峰面积接近。将获得的10 批栽培五指毛桃与21 批野生五指毛桃共有模式进行比较，结果显示，野生五指毛桃无特征峰群A 的2，10，11，12 号峰，特征峰群B 和C 是两者共有的，但峰面积比例差异较大。详见图2至图3。

图2 栽培与野生五指毛桃高效液相色谱叠加指纹图谱A.Cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S22-S31）B.Wild Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S1-S21）Fig.2 HPLC overlay fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

图3 野生（M1）与栽培（M2）五指毛桃对照图谱Fig.3 Reference chromatogram of wild Fici Simplicissimae Radix（sample number M1）and cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample number M2）

共有峰面积比较：比较栽培五指毛桃与野生五指毛桃的共有峰面积，结果显示两者峰面积差异较明显，主要表现在野生五指毛桃特征峰群A的2，8，10，11，12号峰；特征峰群B 和C 为两者共有，特征峰群B 峰面积所占比例差异较大，在特征峰群B 中13，14，15，16号峰野生五指毛桃与栽培五指毛桃的比例分别为47∶1∶3∶13和33∶1∶1∶33。

相似度评价：根据10批栽培五指毛桃指纹图谱测定结果，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）计算不同批次栽培五指毛桃的相似度，结果为0.847～0.947。对21 批野生五指毛桃进行内部相似度分析，结果指纹图谱相似度为0.982～0.998，表明内部相似度结果良好。以栽培五指毛桃的共有模式作为21 批野生五指毛桃的对照图谱，计算得野生五指毛桃的相似度为0.503～0.594，相似度结果较低。详见表2。

表2 野生与栽培五指毛桃指纹图谱相似度Tab.2 Similarity of HPLC fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2.5 化学计量学分析

HCA：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）将10批栽培五指毛桃与21批野生五指毛桃的指纹图谱进行处理，获得HPLC 色谱峰峰面积数据（量化指纹特征）。采用IBM SPSS Statistics 26 统计学软件，将变量设为峰面积进行HCA，在得到的31批五指毛桃样品指纹图谱中采用13号峰（补骨脂素）为对照的19个色谱峰相对峰面积，以欧氏距离平方为聚类统计量、横坐标为样品编号、纵坐标为临界值（不同类别之间的距离），获得31 批五指毛桃样品HCA 图（图4）。临界值越小，谱图相似度越高。结果显示，当临界值为25时，31批样品可聚为两大类，编号为S1 - S21（均为野生五指毛桃）的样品聚为一类，编号为S22 - S31（均为栽培五指毛桃）的样品聚为一类；当临界值为1时，编号为S1-S3（产地为清远连山）的样品聚为一类；编号为S22、S30、S31（金绿生品牌）的样品聚为一类；当临界值为2时，编号为S23、S26、S28（仙逸堂品牌）的样品聚为一类。聚类结果较理想，可有效地将栽培五指毛桃与野生五指毛桃2 个品种区分，还能将不同野生产地及不同饮片加工品牌进行区分。

图4 栽培与野生五指毛桃药材样品的层次聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PCA：采用SIMCA-P14.0 软件［11］，以10 批栽培五指毛桃与21 批野生五指毛桃样品的19 个共有峰的峰面积为X变量、样品批次为Y变量进行无监督的PCA。结果显示，PCA 图中大部分野生五指毛桃样本群与栽培五指毛桃样本群被分成不同的空间聚落，区分效果明显。栽培五指毛桃聚落分布较紧凑；野生五指毛桃聚落分布较分散，离散度大于栽培五指毛桃样本。详见图5。

图5 栽培与野生五指毛桃药材样品主成分分析得分图Fig.5 Scattered plots of PCA of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PLS-DA：在PCA结果的基础上，进一步做有监督的PLS-DA，结果识别模型的解释度（R2X）为0.66，模型的预测度（Q2）为0.794。对栽培五指毛桃与野生五指毛桃进行分组比较（图6），区分效果明显，此结果与PCA 的结果相吻合。根据分组的贡献率（VIP）进行排序（图7）。其中，峰15（芹菜素）、峰13（补骨脂素）、峰16（5-甲氧基补骨脂素）、峰3、峰12、峰8 的VIP 值均大于1.0，表明这6 个组分可能为栽培五指毛桃与野生五指毛桃的质量差异标志物，即以上6个化学组分在栽培五指毛桃与野生五指毛桃中显示一定差异性。

图6 栽培与野生五指毛桃药材样品PLS-DA得分图Fig.6 PLS-DA score plot of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

图7 19个共有峰对分组的贡献值（VIP值）Fig.7 Variable importance of projection（VIP）of the 19 common peaks for grouping

2.6 含量测定

2.6.1 方法学考察

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液2，4，8，12，16，20µL，按2.1项下色谱条件进样测定，以含量（X，µg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表3。

表3 补骨脂素、芹菜素、5-甲氧基补骨脂素线性关系考察结果Tab.3 Results of the linear relation test of psoralen，apigenin and 5-methoxypsoralen

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果补骨脂素、芹菜素、5-甲氧基补骨脂素峰面积的RSD分别为0.56%，0.58%，0.56%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）粉末0.2 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，20，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果补骨脂素、芹菜素、5-甲氧基补骨脂素峰面积的RSD分别为0.87%，1.12%，0.96%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（编号为S1）粉末0.2 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样检测定，记录峰面积。结果补骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基补骨脂素的平均含量分别为每100 g药材含0.065 7，0.007 5，0.022 5 g，RSD分别为1.24%，1.32%，1.27%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（编号为S1）粉末0.1 g，精密称定，置5 mL 容量瓶中，分别加入一定量的补骨脂素、芹菜素、5-甲氧基补骨脂素，平行6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.6.2 样品含量测定

取栽培五指毛桃与野生五指毛桃药材样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算各成分的含量，比较野生五指毛桃与栽培五指毛桃两者的差异［12-13］。结果见表5。

表5 栽培与野生五指毛桃中3种成分含量测定结果（g/100 g，n=3）Tab.5 Results of the content determination of the three components in cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix（g/100 g，n=3）

3 讨论

3.1 指纹图谱共有模式选择

相似度评价采用中药指纹图谱相似度评价系统（2004A版），共有模式按平均值法生成。本研究中将10批栽培五指毛桃和21批野生五指毛桃数据同时导入软件建立共有模式，因两者虽有部分共有峰，但峰面积及峰面积比例差异明显，生成的共有模式融合了两者的特征。以10 批栽培五指毛桃的色谱图生成的对照图谱作为共有模式，结果显示，10 批栽培五指毛桃相似度均高于0.84，表明各批栽培五指毛桃的化学成分种类及性质相似。21 批野生五指毛桃相似度均低于0.6，表明以栽培五指毛桃指纹图谱为共有模式能有效区分栽培五指毛桃与野生五指毛桃。

3.2 色谱条件选择

预试验中，分别考察甲醇-水、乙腈-水溶液流动相体系进行等度洗脱的效果，结果在以乙腈- 水得到的指纹图谱中能较完整地将主要色谱峰分离，并得到较平稳的基线，有利于采集指纹图谱的数据，进一步保障了数据的可重复性；选择230，250，270，320 nm 作为检测波长，结果于不同波长处各色谱峰有较大差异，综合考虑，选定于320 nm 波长处测定，色谱峰数量较多，各峰之间分离度较好，基线较平稳。

3.3 含量测定指标成分选择

由图7 可知，VIP 值排序居前3 的成分分别为芹菜素（峰15）、补骨脂素（峰13）、5-甲氧基补骨脂素（峰16），五指毛桃主要有效成分为补骨脂素、芹菜素等香豆素及黄酮类成分［14-16］。本研究结果显示，10 批栽培五指毛桃3 种化学成分的平均含量分别为每100 g 药材含0.090 3，0.007 7，0.022 9 g，而21 批野生五指毛桃的平均含量分别为每100 g 药材含0.092 1，0.000 8，0.022 0 g。栽培五指毛桃的芹菜素含量明显高于野生五指毛桃，与药材品种、产地、采收季节等有关。故选用上述最具代表性的3个成分进行含量测定。

3.4 方法评价

本研究中采用指纹图谱结合化学计量学方法构建质控模式［17-20］，可将栽培五指毛桃与野生五指毛桃有效区分，体现出品种之间的量化差异。HCA 和PCA 结果基本一致，且与实际相符，说表明本研究中建立的识别模式直观、合理、可行，可作为五指毛桃质量评价主要依据。但因药材取样的局限性，本研究结果不能完全代表各产地栽培五指毛桃与野生五指毛桃的质量差异，应进一步扩大药材样品收集范围或进行其他方面的深入分析，以提高其研究的科学性。