壮药狗蚁草中槲皮素的含量测定

凌庆辉 陈 路

1.广西壮族自治区妇幼保健院药剂科，广西 南宁 530003；2.广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023

狗蚁草为豆科链荚豆属植物链荚豆Alysicarpusvagnalis(Linn.)DC的干燥根、叶及全草，性平、味甘、苦，具有活血通络、驳骨消肿等功效，民间常用于治疗慢性肝炎、跌打损伤等疾病[1-3]。文献研究[4-5]发现，目前国内外仅有2篇文献对狗蚁草中的化学成分(水杨酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇)进行含量测定。研究[6]表明槲皮素能够调控PI3K/AKT/NF- B信号通路，改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠的肝脏炎症症状，对慢性肝炎具有治疗作用，该作用与狗蚁草药材主治慢性肝炎相一致。槲皮素的抗炎作用是其最核心最显著的药理作用之一[7]。本文以槲皮素为指标性成分，探索其含量测定方法，为进一步完善狗蚁草药材质量标准提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；JN-52000DTS型超声波清洗仪(宁波江南仪器厂)；FA2204B型电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；1.槲皮素图1 狗蚁草HPLC色谱图

1.2 材料 甲醇、乙腈、冰醋酸均为色谱纯，水为重蒸水(实验室自制)，其他试剂均为分析纯。槲皮素对照品(批号：100081-201408，中国食品药品检定研究院)；狗蚁草3批样品采自广西南宁市郊，经广西药用植物园蓝鸣生教授鉴定为豆科植物狗蚁草Alysicarpusvagnalis(Linn. )DC。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取槲皮素对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声溶解，再加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，制成每1 mL含槲皮素1.25 g的对照品溶液(1.25 g/mL)。

2.1.2 供试品溶液 取狗蚁草根粗粉约10 g，精密称定，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，残渣用适量甲醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得供试品溶液。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Prevail ODS-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈(A)-1%乙酸(B)；梯度洗脱：0～15 min，5%A；15～20 min，15%A；20～30 min，25%A；30～40 min，65%A；检测波长：365 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。在此条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。色谱图如图1所示。

2.2.2 线性关系考察 依次精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤。分别吸取上述对照品溶液10 μL，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)制作标准曲线，得回归方程：Y=364866X+109.58(R2=0.9996)，如图2所示，表明进样量在0.125～1.25 μg范围内线性关系良好。

图2 标准曲线效果图

2.2.3 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下的对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果槲皮素峰面积的RSD值为1.72%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 取“2.1.2”项下的供试品溶液，分别于0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果槲皮素峰面积的RSD值为0.94%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批南宁产狗蚁草药材6份，按照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定槲皮素含量。结果槲皮素含量的RSD值为1.12%(n=6)，表明重复性良好。

2.2.6 加样回收试验 取已知槲皮素含量(1.0236 mg/g)的同一批南宁产狗蚁草药材干品9份，每份约5 g，精密称定，分别按100%的水平加入槲皮素对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定槲皮素的含量，计算回收率。回收率(%)=[实测值(mg)-样品含量(mg)]/对照品加入量(mg)×100%。结果平均回收率为99.3%，RSD值为1.06%(n=9)，表明回收率良好。详见表1。

表1 加样回收试验结果表 (n=9)

2.2.7 样品测定 取3批狗蚁草药材，每批3份。每份取约10 g，粉碎成粗粉(过40目筛)，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，计算样品中槲皮素的含量。结果见表2。

表2 不同批次狗蚁草槲皮素含量测定表 (n=3)

3 讨论

3.1 含量测定指标成分的选择 根据中药及其制剂分析中含量测定指标成分的选择原则，含量测定指标成分应确保药材及其制剂的有效性、安全性和专属性，研究首选有效成分作为含量测定指标成分[8]。以本研究[6]为例，槲皮素具有抗炎活性，是狗蚁草药材发挥治疗作用的有效成分，同时也是该药材主治功能的重要体现，故选择槲皮素作为含量测定指标成分。

3.2 流动相的选择 在参考文献[9-11]的基础上，对比分析了①甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)、②乙腈-0.4%磷酸溶液(30∶70)、③甲醇-0.4%磷酸溶液(47∶53)3种溶剂系统，最终确定乙腈-1%乙酸为流动相，进行梯度洗脱，槲皮素的分离度大于1.5，色谱图峰形较理想。

狗蚁草是广西壮族民间常用草药，其乙醇提取物具有抗肿瘤、抑菌、抗氧化等多种药理活性，具有较好的开发应用前景[12-14]。目前，狗蚁草化学成分研究较为欠缺，分离鉴定的化合物不足20个，且药理作用研究对象均为提取物，具体是何种成分在起作用尚未明确，还有待进一步研究。