丁香挥发油对小鼠皮肤影响的初步研究

蔡燕萍 赵思烨 颜伟泓 林欣欣 苟文韬 叶明星 吴艺锦 张伟云*

1.厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室，福建 厦门 361023；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾，又称为公丁香，具有药用和食用价值，为我国重点开发药材之一[1]。宋代《开宝本草辑副本》[2]、《证类本草》[3]和明代《本草品汇精要》[4]均记载丁香生交、广南番，现《中华本草》[5]记载产于马来西亚、东非沿岸国家及印度尼西亚，我国海南、广东也有栽培。2020版《药典》中丁香的性味归经记载为：辛，温。归脾、胃、肺、肾经，有温中降逆，补肾助阳的功效，常用于食少吐泻、呃逆呕吐、心腹冷痛等病症的治疗[6]。丁香的干燥花蕾中含有丰富的挥发油，主要成分包括丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯[7]。研究表明丁香挥发油具有抗炎[8]、杀虫[9]、抗氧化[6]、抑菌[10]、麻醉[11]和促进透皮吸收[12]的药理作用。

课题组曾对中药护肤、驱蚊、抑菌洗衣液进行过开发初探，因丁香挥发油具有良好的抑菌效果，所以笔者选用丁香挥发油为这款洗衣液的配方组成之一，但发现目前关于丁香挥发油安全性的研究较少，本研究旨在考察丁香挥发油的皮肤刺激性，以评价该挥发油的安全性，为进一步开发这款中药护肤驱蚊洗衣液提供一定的参考。通过将本实验引入本科生综合性实验教学，有助于巩固学生对药理学理论知识的理解，提高学生的实验实践能力。

1 实验材料

1.1 试剂脱毛膏(广州菲诺化妆品有限公司)

1.2 实验动物 健康SPF级ICR小鼠共28只，雌雄各半，体重20～25 g，杭州医学院提供，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0002，合格证编号：20210506Abzz0100000542(雌)、20210506Abzz 0100000316(雄)。(自由饮食)实验条件：温度20～26 ℃。

1.3 药物与设备 中药丁香购自北京同仁堂厦门禾祥中医门诊部，产地广西。实验所用丁香由厦门大学药学院陈全成副教授和张伟云老师鉴定为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾(EugeniacaryophyllataThunb.)。ZNHW电热套，邦西仪器科技上海有限公司生产；CP512电子天平，奥豪斯仪器有限公司生产。

2 实验方法

2.1 丁香挥发油的提取 取广西丁香药材 1 kg，分为10份，每份分别置于 2000 mL 圆底烧瓶中，1份药材加入8倍量的蒸馏水[13]，浸泡 24 h，采用水蒸气蒸馏法加热提取丁香挥发油 4 h (沸腾前设置 200 ℃，沸腾后可降温为180 ℃)，收集丁香挥发油，转至冰箱4 ℃暂存备用。

2.2 急性皮肤刺激实验(一次给药皮肤刺激实验) 取SPF级ICR小鼠12只，雌雄各半，所有小鼠单笼饲养，随机分为2组，每组6只。一组为正常对照组，一组为实验组。随机分组后，对全部小鼠背部脊柱两侧脱毛，两侧脱毛范围各为 2 cm×3 cm，24 h 后进行皮肤划伤，左侧皮肤不划伤，右侧皮肤划伤为“=”字形，使皮肤表面稍稍出血即可，划伤示意图如图1所示，划伤后立即涂药，空白对照组涂纯水，实验组涂丁香挥发油，给药后均用纱布覆盖，胶布固定，敷用24 h，24 h后用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤后的1 h、24 h、48 h和72 h时观察小鼠左右两侧涂抹部位的皮肤反应，观察小鼠涂抹部位皮肤是否出现红斑、水肿等现象，按表1进行皮肤反应评分[14]，以小鼠积分的平均值进行综合评价，根据24 h、48 h、72 h各观察时点最高积分均值，按表2判定皮肤刺激强度[14]。

图1 小鼠脱毛划伤示意图

表1 皮肤刺激反应评分表

表2 皮肤刺激强度分级表

2.3 多次给药皮肤刺激实验 小鼠的试验方法与急性皮肤刺激实验相同，每天涂抹1次，连续涂抹7 d，去除受试物再观察7 d。每日观察时，需用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤的1 h后再进行观察，按表2进行皮肤反应评分。结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表2判定皮肤刺激强度[14]。

每天每只动物平均积分=∑红斑和水肿积分/受试动物数× 14

3 结果与分析

3.1 急性皮肤刺激性实验(一次给药皮肤刺激实验) 一次给药后，经观察，发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的现象，无死亡，各组小鼠的行为、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠和实验组小鼠的左侧完整皮肤和右侧破损皮肤在清洗完挥发油的1 h、24 h、48 h、72 h的时刻均未发现红斑、水肿等现象。统计分析结果显示，正常对照组与给药正常皮肤组皮肤反应积分比较，正常破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异(P>0.05)，各个时间点皮肤反应积分均值和皮肤刺激强度评价见表3，急性皮肤刺激性实验中小鼠代表性皮肤反应的照片如图2所示。该结果提示丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性。

a.无红斑、水肿的照片 b.无红斑、水肿的照片图2 急性皮肤刺激性实验中小鼠皮肤反应代表性图

表3 急性皮肤刺激实验小鼠皮肤反应积分值 (n=6)

3.2 多次给药皮肤刺激实验 多次给药后，每日观察发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的反应，无死亡，各组小鼠的行为、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠左右两侧皮肤均正常，无出现红斑、水肿等情况。实验组的小鼠前8 d中，每日有2～3只小鼠右侧破损皮肤出现了不同程度的红斑、水肿，而14 d内实验组小鼠的左侧正常皮肤未出现红斑、水肿的情况。停止涂抹挥发油后的第二天开始，小鼠右侧破损皮肤涂抹挥发油部位的红斑与水肿消退，两侧皮肤渐渐均呈现正常状态。统计分析结果显示，空白正常皮肤组与给药正常皮肤组皮肤反应积分比较，空白破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异(P>0.05)，各组每日皮肤反应积分值见表4，皮肤刺激强度评价见表5，多次给药皮肤刺激实验中小鼠代表性皮肤反应的图片如图3所示。

a.有轻微红斑的照片 b.有明显红斑的照片 c.有轻微红斑、轻微水肿的照片图3 多次给药皮肤刺激实验中小鼠皮肤反应代表性图

表4 多次给药皮肤刺激实验小鼠皮肤反应积分值表

表5 多次给药皮肤刺激实验皮肤刺激强度评价 (n=6)

4 讨论与结论

皮肤刺激实验指的是使用产品前要评估其引起皮肤刺激的相关测试，它包括急性皮肤刺激实验和多次皮肤刺激实验两种方法。单次皮肤刺激试验考察被检物对皮肤的直接刺激性和程度[14]，多次皮肤刺激试验不仅能反映被检物对皮肤的直接刺激，而且还能反映被检物对皮肤中远期的慢性累积性刺激[16]。

在急性皮肤刺激实验中，经过24 h连续经完整皮肤和破损皮肤给药，小鼠正常皮肤和破损皮肤的皮肤反应平均积分值为0，小于0.5，未见中毒的反应，这提示使用者在单次使用或偶尔使用时具有一定的安全性，但急性皮肤刺激试验只对较强的刺激原敏感，不能完全说明丁香挥发油外用的安全性，所以课题组开展了多次给药皮肤刺激，在这个实验对强刺激原敏感，对弱刺激原也敏感，可考察每日使用或连续数日使用丁香挥发油对皮肤刺激的有无及大小，经过7天的给药，实验组中个别小鼠的涂抹挥发油的破损皮肤部位出现轻微红斑、明显红斑、轻微水肿、轻度水肿等现象，经计算，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的每天每只动物皮肤积分值分别为0和0.31，均小于0.5，以表2评定皮肤刺激强度，丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性，而针对破损皮肤出现局部皮肤反应的现象，可解释为外用药对破损皮肤稍具刺激性的普遍表现，使用时保证给药皮肤的完整性即可避免[16]。

丁香挥发油作为丁香的主要药效部位，化学成分丰富，药理作用广泛，具有广阔的应用前景[17]。研究结果表明，丁香挥发油对小鼠的正常皮肤和破损皮肤刺激性小，具有一定的安全性，该实验结果为前期课题组中药护肤驱蚊抑菌洗衣液进一步的开发提供了理论参考，也可后期丁香其他的产品的应用和开发提供新的思路，展示了丁香一定的产业应用价值，但是该实验仅在一种实验动物上进行实验，而且数据出现了标准差大于均数的情况，表明数据呈偏态分布的现象，可能是因为实验动物的个体差异性大所导致实验结果具有局限性，仍需在多种实验动物上进行实验互相验证，并扩大或采用人重组皮肤模型进一步实验，以获取更加可靠的结果。整个实验涉及中药化学的提取制备方法与技术、药理学实验的基本操作与技能，有利于激发学生科研兴趣，培养学生创新思维。