双波长HPLC法同时测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A含量

肖琳婧 秦学玲 付兴情 金 蒙 龙 琴 张赟华

云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650106

上清丸来源于《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加减”[1]，但与现行处方一致的上清丸最先记载于《北京市中药成方选集》[2]。上清丸现标准收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册[3]，标准编号为 WS3-B-1878-95，标准收载大蜜丸和水丸两种剂型，后增加水蜜丸的规格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荆芥、防风、桔梗、连翘、栀子、黄芩(酒炒)、黄柏(酒炒)及大黄(酒炒)十二味药材组成。主要有清热散风、解毒通便的功效。临床上常用于头晕耳鸣、目赤、鼻流黄涕、口舌生疮、牙龈肿痛，大便秘结[4]。方中主药大黄清热凉血、泻火通便，黄芩清上焦火，黄柏泻下焦火，栀子泻三焦火；辅以连翘、菊花、薄荷、荆芥、防风疏散风热，清利头目，川芎活血行气止痛，白芷祛风散寒，消肿止痛；佐以桔梗引药上行，宜肺散风，消肿利咽，以消上、中焦风热。文献[5-7]报道，采用HPLC方法对上清丸中的欧前胡素、黄芩苷、绿原酸、大黄中蒽醌类等成分进行含量测定，但对上清丸栀子中栀子苷及连翘中连翘酯苷A 含量测定未见报道。

上清丸为2022年全国中成药评价性抽验重点监管品种之一，本次专项抽验，共抽取上清丸样品103批次。抽样地域覆盖了全国26个省、自治区、直辖市，涉及14家生产企业，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3种剂型。为综合评价市售上清丸中栀子和连翘质量，本实验采用了HPLC双波长同时测定103批样品中栀子苷及连翘酯苷A 含量，以期对上清丸中栀子及连翘的质量进行评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；赛多利斯BS224S电子天平；赛多利斯SECURA225D电子天平。

A.混合对照品溶液；B.缺连翘阴性供试品溶液；C.供试品溶液

1.2 材料 方法学考察用的样品：上清丸(水蜜丸，批号：A12003，广州白云山陈李济药厂有限公司生产)，其余103批次上清丸样品来源于14家生产企业，由于国家专项抽验，涉及数据保密，生产企业由A～N代替，具体信息见表3。栀子苷(批号：110749-201919，含量以97.1%计)、连翘酯苷A(批号：111810-201707，含量以97.2%计)，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院，乙腈为色谱纯(默克公司)，水为纯化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用ZORBAX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱，流速为1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为238 nm(栀子苷)、330 nm(连翘酯苷A)。

表1 梯度洗脱表

2.2 对照品溶液的制备 分别取栀子苷、连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的混合对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品重量差异项下大蜜丸，剪碎，取2 g，精密称定；或取水蜜丸或水丸，研细，取1 g，精密称定，置具塞三角锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按处方比例，在实验室模拟工艺，分别配制缺连翘、栀子的两种细粉，分别取约1 g，同供试品溶液制备，即得两种阴性供试品溶液。

2.5 系统适应性与专属性试验 按“2.2、2.3、2.4”项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品，在上述试验条件下，采用紫外检测器检测，测定，记录色谱图。结果表明上述液相色谱条件下，供试品溶液色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，栀子苷、连翘酯苷A，分离度大于1.5，阴性供试品在相应位置处未见色谱峰，表明其他药味不干扰2种待测成分的测定，方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 ①精密称取栀子苷、连翘酯苷对照品10.41 mg、10.29 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得对照品储备液(C=400 μg/mL)；②精密吸取 5 mL、5 mL、5 mL、1 mL对照品储备液置于 10 mL、20 mL、25 mL、10 mL 量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀；③再取80 μg/ mL的对照品溶液5 mL置于20 mL量瓶、取20 μg/mL对照品溶液置于10 mL量瓶，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得系列线性溶液。取续滤液按“2.1”项下色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，分别计算栀子苷的回归方程为Y=15581X+5599.3(r=1.0000)、连翘酯苷A的回归方程为Y=17230X-21735.4(r=0.9997)，说明栀子苷在 404.32～2.02 μg/mL、连翘酯苷A在 403.96～2.02μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 取混合对照品适量，按上述方法制备，连续6次测定，测得栀子苷、连翘酯苷A的峰面积RSD(n=6)分别为0.14%、0.10%，仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各进样一次，测定各组分的峰面积，栀子苷、连翘酯苷A峰面积RSD(n=6)分别为0.45%、1.20%，样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验 取上清丸(批号：A12003)，按上述方法制备6份供试品溶液，进样测定，测得栀子苷、连翘酯苷A 的含量RSD(n=6)分别为0.29%、0.45%，该方法的重复性良好。

2.10 加样回收试验 分别精密称6份样品(批号：A12003)0.5 g，采用加样回收试验方法，分别按下表精密加入2种对照品溶液，计算回收率和RSD。见表2。

表2 加样回收率实验结果

2.11 含量测定结果 取上清丸103批，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，各精密吸取10 μL，注入HPLC中，采用外标法计算各成分的含量，结果见表3。各生产企业栀子苷含量统计图如图2所示，连翘酯苷A如图3所示。

图2 不同生产企业上清丸栀子苷含量统计图

表3 103批次上清丸样品信息及栀子苷、连翘酯苷A含量测定结果

结果表明不同企业上清丸(大蜜丸)栀子苷的含量较集中且差异较小，但来自C、F、H生产的上清丸栀子苷不同批次间栀子苷含量差异较大。上清丸(水蜜丸)为A企业独家生产，6批次栀子苷的含量差异较大，说明该企业不同批次样品栀子药材质量存在差异。不同企业上清丸(水丸)栀子苷的含量差异大，L企业不同批次之间栀子苷的含量相差3倍。

结果表明不同企业上清丸连翘酯苷含量差异较大，参考《中国药典》2020年版连翘项下规定，青翘和老翘中连翘酯苷A限度相差14倍[8]。其中A企业上清丸(大蜜丸)中的连翘酯苷A的含量相差15倍，水蜜丸中连翘酯苷A的含量相差10倍，主要是青翘和老翘投料不固定，造成连翘酯苷A含量差异较大。结合调研情况，仅有B和M企业固定青翘投料。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本研究比较了不同提取溶剂(90%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇)，不同提取方式(超声30 min、加热回流30 min)，不同回流时间(30 min、45 min、60 min)，最终确定最佳提取条件是70%乙醇加热回流提取30 min。此条件提取较完全，通过上述色谱条件，可以较好地测定上清丸栀子苷及连翘酯苷A含量。

3.2 检测波长的选择 本研究通过二极管阵列检测器检测，栀子苷在238 nm波长附近均最大吸收并参照《中国药典》2020年版一部栀子含量测定项下的规定[9]，选择238 nm 为栀子苷检测波长。连翘中连翘酯苷A在330 nm波长附近有最大吸收，并参照《中国药典》2020年版一部连翘含量测定项下的规定[8]，选择330 nm为连翘酯苷A检测波长。

3.3 流动相的选择 本实验在筛选流动相时，通过对乙腈-水、甲醇-水的运行，筛选出乙腈-水系统优于甲醇-水系统，但色谱峰出现了拖尾现象，进而以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，同时测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A 含量。结果发现，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱时，供试品中栀子苷和连翘酯苷A可达到基线分离，峰型较好，并且干扰较少，出峰时间适中，故选取此条件为流动相。

3.4 样品分析 通过测定103批上清丸栀子苷，部分企业上清丸不同批次间栀子苷含量的存在较大差异，说明各批次间均一性较差。为了提高上清丸的一致性，相关企业应加强对投料栀子的质量控制，对栀子产地、采收时间做出相应的规定。

通过测定103批上清丸连翘酯苷A含量，部分企业上清丸中连翘酯苷A含量差异巨大，主要原因是上清丸中连翘投料不固定。为了保证上清丸质量的均一性，各生产企业应固定青翘或老翘投料。

本实验采用HPLC结合双波长同时测定栀子苷及连翘酯苷A含量。所建立的方法操作简单、结果准确，不同企业不同批次上清丸中栀子苷及连翘酯苷A的含量存在一定差异，可能与制剂生产所用原药材的产地、来源、采收季节以及原药材批间质量差异等因素有关，提示相关生产企业关注栀子及连翘原药材质量，并且在连翘投料过程固定青翘或老翘投料，不断提高和完善上清丸的质量控制标准，确保上清丸质量稳定和临床疗效一致。