止泻灵糖浆质量标准提升及特征图谱研究

闵建国 黄美仙 戴 航 周艳林 李江旗

1.桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004；2.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；3.桂林市政务服务中心，广西 桂林 541100

止泻灵糖浆收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册[1]，处方由五倍子、鸡矢藤、车前草、陈皮、地胆草、儿茶、莱菔子、白术、伏龙肝、党参和滑石粉等11味药组成，被广西壮族自治区中医药管理局认定为民族药。其具有健脾、清热利湿、涩肠止泻之功，临床上用于治疗急性肠炎、小儿消化不良、单纯性腹泻等，具有较好疗效。该品种处方药味药性平和，无虎狼药味，较适用于儿童相应病症的治疗。该品种现行质量标准比较粗放，仅有2项颜色反应鉴别项，缺乏处方药材专属性鉴别和含量测定等定量控制指标，难以保证药品的质量和疗效稳定性，尚未见止泻灵糖浆质量标准的研究报道。为了更好地控制止泻灵糖浆的质量，借助薄层色谱法(TLC)对其方中五倍子、陈皮进行鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)测定成品中橙皮苷的含量，并建立其乙酸乙酯部位特征图谱，可为止泻灵糖浆质量标准提高提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪(含Waters 2996二极管距阵检测仪，Empower 2色谱工作站)；Waters symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；卡玛ATS4薄层色谱自动点样仪(瑞士)；卡玛TV2薄层色谱成像仪(瑞士)；BEG-60离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药 没食子酸对照品(批号121261-201303，纯度：99.7%)、橙皮苷(批号：110721-201818，纯度：96.2%)、陈皮对照药材(批号：121261-201303)均购自中国食品药品检定研究院。止泻灵糖浆样品(批号：170923、170926、171203、171206、180502、180901、181101、181102、190301、190302、191101、200301)、缺五倍子阴性和缺陈皮阴性样品均由桂林三金药业股份有限公司按处方制备；乙腈、甲醇(色谱纯)；冰醋酸(分析纯)，液相用水为超纯水，其余化学试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 五倍子[2]68[3]取止泻灵糖浆5 mL，置于15 mL的离心管，加乙酸乙酯5 mL，振摇提取后离心(5 min，3000 rpm)，吸取上清液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10～15 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果显示阴性无干扰。如图1所示。

1.缺五倍子阴性样品；2.没食子酸对照品；3～5.止泻灵糖浆 (批号：170623、170626、181101)图1 五倍子薄层色谱图

2.1.2 陈皮[2]199[4-5]取止泻灵糖浆3 mL，置于 15 mL 离心管，加水2 mL和乙酸乙酯-正丁醇(1∶1)混合液2 mL，振摇提取后离心(5 min，3000 rpm)，吸取上清液1 mL，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取陈皮对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2～5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上使成条带状，以三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，于紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果显示阴性无干扰。如图2所示。

1.缺陈皮阴性样品；2.陈皮对照药材；3～5.止泻灵糖浆供试品(批号：170623、170626、181101)图2 陈皮薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters symmetry C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇-6%冰醋酸水溶液(35∶65)；检测波长：283 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。色谱图见图3。

1.橙皮苷；a.橙皮苷对照品溶液；b.供试品溶液；c.缺陈皮阴性样品液；d.甲醇空白样液图3 止泻灵糖浆高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品19.83 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；精密吸取对照品储备溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取止泻灵糖浆2 mL，加水2 mL，摇匀后加水饱和正丁醇溶液振摇提取3次，每次5 mL，振摇后离心(5 min，3000 rpm)，合并正丁醇液，蒸干，残渣用适量甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 缺陈皮阴性样品溶液制备 取缺陈皮的阴性样品2 mL，按2.2.3 项下方法制成阴性样品溶液。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系考察 取2.2.2项下对照品溶液，精密吸取橙皮苷对照品储备溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。以橙皮苷的量为横坐标(X)，橙皮苷峰的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=1.83×106X+1.34×103，r=0.9999。结果表明，橙皮苷进样量在0.190765～3.815292 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.5.2 精密度试验 取止泻灵糖浆(批号：181101)2 mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件连续进样测定 6 次，计算橙皮苷的含量。6次测定结果的平均值为0.341 mg/mL，RSD为0.25%(n=6)。结果表明方法精密度良好。

2.2.5.3 重复性实验 取止泻灵糖浆(批号：181101)2 mL，共6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件测定橙皮苷含量，6份样品中橙皮苷的平均含量为0.336 mg/mL，RSD为1.42%(n=6)。结果表明方法重现性良好。

2.2.5.4 稳定性实验 取2.2.5.3项下同一份供试品溶液，分别于制备后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h进样测定，6次测定结果的平均值为0.340 mg/mL，RSD为1.89%(n=6)。结果表明供试品溶液在室温放置48 h内基本稳定。

2.2.5.5 加样回收率试验 精密移取重现性试验同一批号样品1 mL，共6份，分别精密加入橙皮苷对照品储备溶液1 mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件测定橙皮苷含量，计算加样回收率，结果见表1。加样回收试验结果显示：平均回收率101.63%，RSD为0.77%(n=6)，表明方法的准确度良好。

表1 加样回收试验结果

2.2.5.6 样品测定 取12批次止泻灵糖浆，按“2.2.3”和“2.2.1”项下方法处理、测定，计算橙皮苷含量。结果见表2。

表2 12批次止泻灵糖浆样品橙皮苷的含量测定结果

2.3 特征图谱[6-7]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 流动相为乙腈(A)-6%冰醋酸水溶液(B)体系，洗脱梯度：0～30 min；A：15%～30%，30～60 min；A：30%～60%；进样量为20 μL；其他同含量测定项。在上述色谱条件下，理论塔板数以橙皮苷计，不低于7000，分离度大于1.5。

2.3.2 供试品溶液制备 精密移取7 mL止泻灵糖浆置于离心管中，加乙酸乙酯 5 mL，摇匀后离心，取上清液，重复操作3次，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，滤过，即得。

2.3.3 方法考察

2.3.3.1 精密度试验 取止泻灵糖浆(170923)按2.3.2项和2.3.1项制备供试品溶液并测定，连续测定6次。以2号峰(橙皮苷)为参照峰，各特征峰的相对峰面积波动RSD小于0.48%，相对保留时间波动RSD小于0.27%，表明该方法的精密度良好。

2.3.3.2 重复性试验 取止泻灵糖浆(170923)6份，按2.3.2项和2.3.1项制备供试品溶液并测定。以2号峰(橙皮苷)为参照峰，各特征峰的相对峰面积波动RSD小于1.24%，相对保留时间波动RSD小于0.41%，表明该方法的重复性良好。

2.3.3.3 中间精密度试验 取2.3.3.2项6份供试品，按2.3.1项方法于赛默飞U3000型液相仪测定，以2号峰(橙皮苷)为参照峰，各特征峰的相对峰面积波动RSD小于0.95%，相对保留时间波动RSD小于0.62%。测定结果与重复性考察所用waterse2695型液相仪测定结果比较，不同仪器间各特征峰相对峰面积波动RSD范围是0.3%～4.7%，相对保留时间波动RSD范围是0.2%～2.9%，表明该方法的于不同仪器设备上的重现性良好。

2.3.3.4 稳定性试验取 2.3.3.1项供试品溶液，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h按2.3.1项方法测定，以2号峰(橙皮苷)为参照峰，各特征峰的峰面积波动RSD小于2.55%，相对保留时间波动RSD小于1.93%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 对照特征图谱的生成 取各批次止泻灵糖浆，按2.3.2项制备供试品溶液，并按2.3.1项测定，将获得的图谱带入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》处理并计算，共标定10个主要成分为共有峰，生成的对照特征图谱(R)如图4所示。

2-橙皮苷图4 止泻灵糖浆对照特征图谱

通过相似度计算，各批次间的相似度均大于0.9，结果如表3所示，色谱图如图5所示，说明该方法可用于止泻灵糖浆的质量控制。

表3 各批次样品的相似度

图5 各批次样品的特征图谱

2.3.4 共有峰归属分析 取处方各药材适量，加甲醇制成含药材量与成品含药材量等同的供试品溶液，并按2.3.1测定，结果如图6所示。结果表明，1号和3号色谱峰来源于陈皮和车前草，2号、4号、6号、8号和9号色谱峰来源于陈皮，5号色谱峰来源于鸡矢藤和车前草，7号色谱峰来源于鸡矢藤。

图6 共有峰归属分析图

3 讨论

3.1 五倍子的薄层鉴别 本品处方君药五倍子具有良好的抑菌作用[8]，所含鞣质、没食子酸也是其发挥止泻作用的主要特征性成分，以没食子酸为对照的薄层鉴别具有较好的专属性，阴性对照无干扰。《中国药典》2020年版“五倍子”中没食子酸的检视方法为254 nm荧光斑点，对比发现采用2%三氯化铁显色，显色斑点更清晰。

3.2 陈皮的薄层鉴别 通过HPLC方法分析成品色谱图各峰归属实验发现，成品色谱图中多个色谱峰能与陈皮药材对应，故增加以陈皮对照药材为对照的薄层鉴别项。比较了《中国药典》2020年版“陈皮”和“保和颗粒”中橙皮苷的鉴别方法，结果以聚酰胺薄膜为层析介质效果更佳。

3.3 橙皮苷的含量测定 止泻灵糖浆中橙皮苷的测定方法参考《中国药典》2020年版“陈皮”【含量测定】项，通过柱温、流动相的pH值和流速等因素考察，表明方法具有良好的适用性及耐用性。

3.4 成品的特征图谱的供试品处理方法 特征图谱可以科学地评价药物的真伪和批次间的质量差异，止泻灵糖浆为糖浆剂，其供试品溶液制备需除糖纯化步骤，对比有机溶剂萃取法和大孔树脂柱层析法，结果表明，乙酸乙酯萃取法制备的供试品溶液色谱图中色谱峰丰富，且基线和各峰分离度较好，能较全面地反映成品的质量。