双波长HPLC法同时测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A含量

肖琳婧 秦学玲 付兴情 金蒙 龙琴 张赟华

【摘 要】目的：建立HPLC的方法测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A 含量，对市售上清丸中栀子、连翘的质量进行评价。方法：采用ZORBAX C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱，流速为1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为238 nm（栀子苷）、330 nm（连翘酯苷A）。结果：103批上清丸2种成分线性良好（r=0.9997～1.0000），平均加样回收率96.70%～96.92%（RSD值为2.2%）。部分企业上清丸不同批次间栀子苷含量存在较大差异，说明各批次间均一性较差；部分企业上清丸中连翘酯苷A含量差异巨大，主要原因是上清丸中连翘投料不固定，为了保证上清丸质量的均一性，各生产企业应固定青翘或老翘投料。结论：该分析方法简单可行，具有良好精密度、重复性和稳定性，为上清丸中栀子及连翘质量评价提供参考。

【关键词】 上清丸;高效液相色谱法;栀子苷;连翘酯苷A

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）17-0035-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.17.zgmzmjyyzz202317009

Simultaneous Determination of Geniposide and Forsythia A in Shangqing Pills by Dual Wavelength HPLC

XIAO Linjing QIN Xuelin FU Xingqing JIN Meng LONG Qin ZHANG Yunhua*

Yunnan institute for food and drug control， Kunming 650106， China

Abstract： Objective To establish simultaneous determination method of geniposide and forsythia A in Shangqing Pills by HPLC. Methods Separation was performed on a ZORBAX Eclipse-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate at 1 mL/min， the column temperature at 30 ℃， the detection wavelength at 238 nm and 330 nm， and the injection volume was 10 μL. Results The contents of forsythia A in 103 batches of Shangqing Pills were significantly different. There was a good linear relationships of four compoments in Shangqing Pills， with average recoveries of 96.70%-96.92%（RSD 2.2%）. The content of jasminoside in different batches of Shangqing pills of some enterprises were significantly different， indicating poor uniformity among batches. The content of forsythia A in Shangqing pills of different enterprises were different. In order to ensure the uniformity of the quality of Shangqing Pills， the enterprises should be fixed to use qingqiao or laoqiao. Conclusion The analytical method is simple and feasible， with good precision， repeatability and stability. The method can provide a reference for the quality evaluation of Shangqing Pills.

Key words：Shangqing Pills; HPLC; Geniposides; Forsythia A

上清丸來源于《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加减”［1］，但与现行处方一致的上清丸最先记载于《北京市中药成方选集》［2］。上清丸现标准收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册［3］，标准编号为 WS3-B-1878-95，标准收载大蜜丸和水丸两种剂型，后增加水蜜丸的规格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荆芥、防风、桔梗、连翘、栀子、黄芩（酒炒）、黄柏（酒炒）及大黄（酒炒）十二味药材组成。主要有清热散风、解毒通便的功效。临床上常用于头晕耳鸣、目赤、鼻流黄涕、口舌生疮、牙龈肿痛，大便秘结［4］。方中主药大黄清热凉血、泻火通便，黄芩清上焦火，黄柏泻下焦火，栀子泻三焦火；辅以连翘、菊花、薄荷、荆芥、防风疏散风热，清利头目，川芎活血行气止痛，白芷祛风散寒，消肿止痛；佐以桔梗引药上行，宜肺散风，消肿利咽，以消上、中焦风热。文献［5-7］报道，采用HPLC方法对上清丸中的欧前胡素、黄芩苷、绿原酸、大黄中蒽醌类等成分进行含量测定，但对上清丸栀子中栀子苷及连翘中连翘酯苷A 含量测定未见报道。

上清丸为2022年全国中成药评价性抽验重点监管品种之一，本次专项抽验，共抽取上清丸样品103批次。抽样地域覆盖了全国26个省、自治区、直辖市，涉及14家生产企业，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3种剂型。为综合评价市售上清丸中栀子和连翘质量，本实验采用了HPLC双波长同时测定103批样品中栀子苷及连翘酯苷A 含量，以期对上清丸中栀子及连翘的质量进行评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；赛多利斯BS224S电子天平；赛多利斯SECURA225D电子天平。

1.2 材料 方法学考察用的样品：上清丸（水蜜丸，批号：A12003，广州白云山陈李济药厂有限公司生产），其余103批次上清丸样品来源于14家生产企业，由于国家专项抽验，涉及数据保密，生产企业由A～N代替，具体信息见表3。栀子苷（批号：110749-201919，含量以97.1%计）、连翘酯苷A（批号：111810-201707，含量以97.2%计），以上对照品均购于中国食品药品检定研究院，乙腈为色谱纯（默克公司），水为纯化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用ZORBAXC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温30℃，检测波长为238nm（栀子苷）、330nm（连翘酯苷A）。

2.2 对照品溶液的制备 分别取栀子苷、连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含40μg的混合对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品重量差异项下大蜜丸，剪碎，取2 g，精密称定；或取水蜜丸或水丸，研细，取1 g，精密称定，置具塞三角锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按处方比例，在实验室模拟工艺，分别配制缺连翘、栀子的两种细粉，分别取约1 g，同供试品溶液制备，即得两种阴性供试品溶液。

2.5 系统适应性与专属性试验 按“2.2、2.3、2.4”项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品，在上述试验条件下，采用紫外检测器检测，测定，记录色谱图。结果表明上述液相色谱条件下，供试品溶液色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，栀子苷、连翘酯苷A，分离度大于1.5，阴性供试品在相应位置处未见色谱峰，表明其他药味不干扰2种待测成分的测定，方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 ①精密称取栀子苷、连翘酯苷对照品10.41mg、10.29mg置于25mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得对照品储备液（C=400μg/mL）；②精密吸取 5mL、5mL、5mL、1mL对照品储备液置于 10mL、20mL、25mL、10mL 量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀；③再取80μg/mL的对照品溶液5mL置于20mL量瓶、取20μg/mL对照品溶液置于10mL量瓶，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得系列线性溶液。取续滤液按“2.1”项下色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度（μg/mL） 为横坐标，分别计算栀子苷的回归方程为Y=15581X+5599.3（r=1.0000）、连翘酯苷A的回归方程为Y=17230X-21735.4（r=0.9997），说明栀子苷在 404.32～2.02 μg/mL、连翘酯苷A在 403.96～2.02μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 取混合对照品适量，按上述方法制备，连续6次测定，测得栀子苷、连翘酯苷A的峰面积RSD（n=6） 分别为0.14%、0.10%，仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各进样一次，测定各组分的峰面积，栀子苷、连翘酯苷A峰面积RSD（n=6）分别为0.45%、1.20%，样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验 取上清丸（批号：A12003），按上述方法制备6份供试品溶液，进样测定，测得栀子苷、连翘酯苷A 的含量RSD（n=6）分别为0.29%、0.45%，该方法的重复性良好。

2.10 加样回收试验 分别精密称6份样品（批號：A12003） 0.5 g，采用加样回收试验方法，分别按下表精密加入2种对照品溶液，计算回收率和RSD。见表2。

2.11 含量测定结果 取上清丸103批，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，各精密吸取10 μＬ，注入HPLC中，采用外标法计算各成分的含量，结果见表3。各生产企业栀子苷含量统计图如图2所示，连翘酯苷A如图3所示。

结果表明不同企业上清丸（大蜜丸）栀子苷的含量较集中且差异较小，但来自C、F、H生产的上清丸栀子苷不同批次间栀子苷含量差异较大。上清丸（水蜜丸）为A企业独家生产，6批次栀子苷的含量差异较大，说明该企业不同批次样品栀子药材质量存在差异。不同企业上清丸（水丸）栀子苷的含量差异大，L企业不同批次之间栀子苷的含量相差3倍。

结果表明不同企业上清丸连翘酯苷含量差异较大，参考《中国药典》2020年版连翘项下规定，青翘和老翘中连翘酯苷A限度相差14倍［8］。其中A企业上清丸（大蜜丸）中的连翘酯苷A的含量相差15倍，水蜜丸中连翘酯苷A的含量相差10倍，主要是青翘和老翘投料不固定，造成连翘酯苷A含量差异较大。结合调研情况，仅有B和M企业固定青翘投料。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本研究比较了不同提取溶剂（90%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇），不同提取方式（超声30min、加热回流30min），不同回流时间（30min、45min、60min），最终确定最佳提取条件是70%乙醇加热回流提取30min。此条件提取较完全，通过上述色谱条件，可以较好地测定上清丸栀子苷及连翘酯苷A含量。

3.2 检测波长的选择 本研究通过二极管阵列检测器检测，栀子苷在238nm波长附近均最大吸收并参照《中国药典》2020年版一部栀子含量测定项下的规定［9］，选择238nm 为栀子苷检测波长。连翘中连翘酯苷A在330nm波长附近有最大吸收，并参照《中国藥典》2020年版一部连翘含量测定项下的规定［8］，选择330nm为连翘酯苷A检测波长。

3.3 流动相的选择 本实验在筛选流动相时，通过对乙腈-水、甲醇-水的运行，筛选出乙腈-水系统优于甲醇-水系统，但色谱峰出现了拖尾现象，进而以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，同时测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A 含量。结果发现，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱时，供试品中栀子苷和连翘酯苷A可达到基线分离，峰型较好，并且干扰较少，出峰时间适中，故选取此条件为流动相。

3.4 样品分析 通过测定103批上清丸栀子苷，部分企业上清丸不同批次间栀子苷含量的存在较大差异，说明各批次间均一性较差。为了提高上清丸的一致性，相关企业应加强对投料栀子的质量控制，对栀子产地、采收时间做出相应的规定。

通过测定103批上清丸连翘酯苷A含量，部分企业上清丸中连翘酯苷A含量差异巨大，主要原因是上清丸中连翘投料不固定。为了保证上清丸质量的均一性，各生产企业应固定青翘或老翘投料。

本实验采用HPLC结合双波长同时测定栀子苷及连翘酯苷A含量。所建立的方法操作简单、结果准确，不同企业不同批次上清丸中栀子苷及连翘酯苷A的含量存在一定差异，可能与制剂生产所用原药材的产地、来源、采收季节以及原药材批间质量差异等因素有关，提示相关生产企业关注栀子及连翘原药材质量，并且在连翘投料过程固定青翘或老翘投料，不断提高和完善上清丸的质量控制标准，确保上清丸质量稳定和临床疗效一致。

参考文献

［1］朱丹溪. 丹溪心法 ［M］. 北京： 中国中医药出版社， 2008： 215.

［2］北京市公共卫生局. 北京市中药成方选集 ［M］. 北京： 人民卫生出版社， 1961： 62.

［3］中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准： 中药成方制剂（第十册） ［S］. 北京： 中华人民共和国卫生部， 1995： 8.

［4］张桥， 陈艳琰， 乐世俊， 等. 大黄炮制的历史沿革及对化学成分、传统药理作用影响的研究进展 ［J］. 中国中药杂志， 2021， 46（3）：539-551.

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［6］周远雄， 陈繁华. 高效液相色谱-可变波长检测法用于上清丸的质量标准提高 ［J］. 中国医药科学， 2018， 8（9）： 53-55.

［7］黄敏，陆石英，叶萍.HPLC法测定上清丸中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量 ［J］.中国材，2013，36（7）：1174-1176.

［8］国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部［S］ .北京：中国医药科技出版社， 2020：177-178.

［9］国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部［S］ .北京：中国医药科技出版社， 2020：259-260.