丁香挥发油对小鼠皮肤影响的初步研究

2023-10-02蔡燕萍赵思烨颜伟泓林欣欣苟文韬叶明星吴艺锦张伟云

中国民族民间医药·上半月 2023年9期

蔡燕萍赵思烨颜伟泓林欣欣苟文韬叶明星吴艺锦张伟云

【摘要】目的：為了培养学生的科学素养能力，引导学生将科研课题“丁香挥发油对小鼠正常皮肤及破损皮肤的影响”设计成本科生初步研究性实验。通过考察丁香挥发油的皮肤刺激性，评价该挥发油的安全性。方法：参照《化妆品安全技术规范》（2015版），采用急性皮肤刺激性实验和多次给药皮肤刺激实验。结果：急性皮肤刺激性实验中，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的皮肤反应平均积分值都为0；多次给药皮肤刺激实验中，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的每天每只动物皮肤反应平均积分分别为0和0.31，以上各组积分均小于0.5，初步表明该挥发油为无刺激性。结论：广西产地的丁香挥发油对小鼠的正常皮肤和破损皮肤刺激性小，具有一定的安全性，展示了丁香一定的应用价值。该实验包含提取制备技术和急性皮肤刺激性实验的原理、操作，对本科生的客观实际分析能力和解决问题能力起到正向反馈的作用，以便为学生今后进行科学研究打下初步的基础。

【关键词】丁香挥发油；皮肤刺激性；小鼠；安全性

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）17-0023-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.17.zgmzmjyyzz202317006

Preliminary Research on the Effect of Volatile Oil from Eugenia caryophyllata Thunb.on the Skin of Mice

CAI Yanping1 ZHAO Siye2 YAN Weihong1 LIN Xinxin1 GOU Wentao1 YE Mingxing1 WU Yijin1 ZHANG Weiyun1，2*

1.Department of pharmacy， Xiamen Medical College/Xiamen Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Bio-engineering，Fujian Province，Xiamen 361023，China; 2.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China

Abstract：Objective In order to cultivate students scientific literacy ability， guide students to design a preliminary experiment for undergraduates on the scientific research project “The Effect of Volatile Oil from Eugenia caryophyllata Thunb. on the Skin of Mice”. The skin irritation of Eugenia caryophyllata Thunb. was investigated to evaluate its safety. Methods With reference to Cosmetic safety tehnical specification（2015 Edition） issued by the Peoples Republic of China， the acute skin irritation experiment and multiple drug administration skin irritation experiment were adopted.Results In the acute skin irritation experiment， the average score of skin reaction of normal skin and damaged skin in the experimental group were 0; In the skin stimulation experiment of multiple administration， the average scores of skin reaction of each animal of normal skin and damaged skin of mice in the experimental group were 0 and 0.31， respectively， and the scores of the above groups were less than 0.5， indicating that the volatile oil was non irritant. Conclusion The volatile oil of Eugenia caryophyllata Thunb. from Guangxi province had little irritation to normal skin and broken skin in mice， and has certain safety， which shows that Eugenia caryophyllata Thunb. had a good application prospect. The experiment included extraction and preparation technology and the principle and operation of acute skin irritation experiment， which played a positive feedback role on undergraduates ability to analyze and problem-solving according to the objective reality， so as to lay a preliminary foundation for future scientific research.

Key words：Volatile oil; Eugenia caryophyllata Thunb.; Skin Irritation; Mice; Safety

丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾，又称为公丁香，具有药用和食用价值，为我国重点开发药材之一［1］。宋代《开宝本草辑副本》［2］、《证类本草》［3］和明代《本草品汇精要》［4］均记载丁香生交、广南番，现《中华本草》［5］记载产于马来西亚、东非沿岸国家及印度尼西亚，我国海南、广东也有栽培。2020版《药典》中丁香的性味归经记载为：辛，温。归脾、胃、肺、肾经，有温中降逆，补肾助阳的功效，常用于食少吐泻、呃逆呕吐、心腹冷痛等病症的治疗［6］。丁香的干燥花蕾中含有丰富的挥发油，主要成分包括丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯［7］。研究表明丁香挥发油具有抗炎［8］、杀虫［9］、抗氧化［6］、抑菌［10］、麻醉［11］和促进透皮吸收［12］的药理作用。

课题组曾对中药护肤、驱蚊、抑菌洗衣液进行过开发初探，因丁香挥发油具有良好的抑菌效果，所以笔者选用丁香挥发油为这款洗衣液的配方组成之一，但发现目前关于丁香挥发油安全性的研究较少，本研究旨在考察丁香挥发油的皮肤刺激性，以评价该挥发油的安全性，为进一步开发这款中药护肤驱蚊洗衣液提供一定的参考。通过将本实验引入本科生综合性实验教学，有助于巩固学生对药理学理论知识的理解，提高学生的实验实践能力。

1 实验材料

1.1 试剂脱毛膏（广州菲诺化妆品有限公司）

1.2 实验动物健康SPF级ICR小鼠共28只，雌雄各半，体重20～25 g，杭州医学院提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，合格证编号：20210506Abzz0100000542（雌）、20210506Abzz 0100000316（雄）。（自由饮食）实验条件：温度20～26 ℃。

1.3 药物与设备中药丁香购自北京同仁堂厦门禾祥中医门诊部，产地广西。实验所用丁香由厦门大学药学院陈全成副教授和张伟云老师鉴定为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾（Eugenia caryophyllata Thunb.）。ZNHW电热套，邦西仪器科技上海有限公司生产；CP512电子天平，奥豪斯仪器有限公司生产。

2 实验方法

2.1 丁香挥发油的提取取广西丁香药材1 kg，分为10份，每份分别置于2000 mL圆底烧瓶中，1份药材加入8倍量的蒸馏水［13］，浸泡24 h，采用水蒸气蒸馏法加热提取丁香挥发油4 h （沸腾前设置200 ℃，沸腾后可降温为180 ℃），收集丁香挥发油，转至冰箱4 ℃暂存备用。

2.2 急性皮肤刺激实验（一次给药皮肤刺激实验）取SPF级ICR小鼠12只，雌雄各半，所有小鼠单笼饲养，随机分为2组，每组6只。一组为正常对照组，一组为实验组。随机分组后，对全部小鼠背部脊柱两侧脱毛，两侧脱毛范围各为2 cm×3 cm，24 h后进行皮肤划伤，左侧皮肤不划伤，右侧皮肤划伤为“=”字形，使皮肤表面稍稍出血即可，划伤示意图如图1所示，划伤后立即涂药，空白对照组涂纯水，实验组涂丁香挥发油，给药后均用纱布覆盖，胶布固定，敷用24 h，24 h后用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤后的1 h、24 h、48 h和72 h时观察小鼠左右两侧涂抹部位的皮肤反应，观察小鼠涂抹部位皮肤是否出现红斑、水肿等现象，按表1进行皮肤反应评分［14］，以小鼠积分的平均值进行综合评价，根据24 h、48 h、72 h各观察时点最高积分均值，按表2判定皮肤刺激强度［14］。

2.3 多次给药皮肤刺激实验小鼠的试验方法与急性皮肤刺激实验相同，每天涂抹1次，连续涂抹7 d，去除受试物再观察7 d。每日观察时，需用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤的1 h后再进行观察，按表2进行皮肤反应评分。结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表2判定皮肤刺激强度［14］。

每天每只动物平均积分=∑红斑和水肿积分/受试动物数× 14

2.4 统计学分析对每天小鼠皮肤反应积分采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理（对照组与实验组比较），采用配对t检验的统计学方法进行分析，计量资料以均数加减标准差（x±s）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 急性皮肤刺激性实验（一次给药皮肤刺激实验）一次给药后，经观察，发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的现象，无死亡，各组小鼠的行为、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠和实验组小鼠的左侧完整皮肤和右侧破损皮肤在清洗完挥发油的1 h、24 h、48 h、72 h的时刻均未发现红斑、水肿等现象。统计分析结果显示，正常对照组与给药正常皮肤组皮肤反应积分比较，正常破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异（P＞0.05），各个时间点皮肤反应积分均值和皮肤刺激强度评价见表3，急性皮肤刺激性实验中小鼠代表性皮肤反应的照片如图2所示。该结果提示丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性。

3.2 多次给药皮肤刺激实验多次给药后，每日观察发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的反应，无死亡，各组小鼠的行为、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠左右两侧皮肤均正常，无出现红斑、水肿等情况。实验组的小鼠前8 d中，每日有2～3只小鼠右侧破损皮肤出现了不同程度的红斑、水肿，而14 d内实验组小鼠的左侧正常皮肤未出现红斑、水肿的情况。停止涂抹挥发油后的第二天开始，小鼠右侧破损皮肤涂抹挥发油部位的红斑与水肿消退，两侧皮肤渐渐均呈现正常状态。统计分析结果显示，空白正常皮肤组与给药正常皮肤组皮肤反应积分比较，空白破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异（P＞0.05），各组每日皮肤反應积分值见表4，皮肤刺激强度评价见表5，多次给药皮肤刺激实验中小鼠代表性皮肤反应的图片如图3所示。

4 讨论与结论

皮肤刺激实验指的是使用产品前要评估其引起皮肤刺激的相关测试，它包括急性皮肤刺激实验和多次皮肤刺激实验两种方法。单次皮肤刺激试验考察被检物对皮肤的直接刺激性和程度［14］，多次皮肤刺激试验不仅能反映被检物对皮肤的直接刺激，而且还能反映被检物对皮肤中远期的慢性累积性刺激［16］。

在急性皮肤刺激实验中，经过24 h连续经完整皮肤和破损皮肤给药，小鼠正常皮肤和破损皮肤的皮肤反应平均积分值为0，小于0.5，未见中毒的反应，这提示使用者在单次使用或偶尔使用时具有一定的安全性，但急性皮肤刺激试验只对较强的刺激原敏感，不能完全说明丁香挥发油外用的安全性，所以课题组开展了多次给药皮肤刺激，在这个实验对强刺激原敏感，对弱刺激原也敏感，可考察每日使用或连续数日使用丁香挥发油对皮肤刺激的有无及大小，经过7天的给药，实验组中个别小鼠的涂抹挥发油的破损皮肤部位出现轻微红斑、明显红斑、轻微水肿、轻度水肿等现象，经计算，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的每天每只动物皮肤积分值分别为0和0.31，均小于0.5，以表2评定皮肤刺激强度，丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性，而针对破损皮肤出现局部皮肤反应的现象，可解释为外用药对破损皮肤稍具刺激性的普遍表现，使用时保证给药皮肤的完整性即可避免［16］。

丁香挥发油作为丁香的主要药效部位，化学成分丰富，药理作用广泛，具有广阔的应用前景［17］。研究结果表明，丁香挥发油对小鼠的正常皮肤和破损皮肤刺激性小，具有一定的安全性，该实验结果为前期课题组中药护肤驱蚊抑菌洗衣液进一步的开发提供了理论参考，也可后期丁香其他的产品的应用和开发提供新的思路，展示了丁香一定的产业应用价值，但是该实验仅在一种实验动物上进行实验，而且数据出现了标准差大于均数的情况，表明数据呈偏态分布的现象，可能是因为实验动物的个体差异性大所导致实验结果具有局限性，仍需在多种实验动物上进行实验互相验证，并扩大或采用人重组皮肤模型进一步实验，以获取更加可靠的结果。整个实验涉及中药化学的提取制备方法与技术、药理学实验的基本操作与技能，有利于激发学生科研兴趣，培养学生创新思维。

参考文献

［1］张小飞，万娜，王学成，等. 丁香挥发油理化性质、提取工艺参数与其芳香水稳定性的相关性研究［J］.中草药，2016，47（22）：3975-3981.

［2］宋·卢多逊. 开宝本草辑副本［M］. 尚志钧，辑校. 合肥：安徽科学技术出版社， 1998：271.

［3］宋·唐慎微. 证类本草［M］. 尚志钧，等校点. 北京：华夏出版社， 1993：362-363.

［4］明·刘文泰. 本草品汇精要［M］. 曹晖，校注. 北京：华夏出版社， 2004：319.

［5］国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草［M］. 上海：上海科学技术出版社， 1999：646-650.

［6］李莎莎，李凡，李芳，等. 丁香的化学成分与药理作用研究进展［J］. 西北药学杂志， 2021，36（5）：863-868.

［7］陈志雄，李友霞，赵世兴，等. 丁香花蕾油的分子蒸馏分离及GC-MS分析［J］. 香料香精化妆品， 2016（2）：21-25.

［8］杨冰，李婷婷，杨伊涵，等. 丁香油抗炎镇痛效果的研究［J］.绿色科技， 2017，19（20）：182-185.

［9］涂小芳. 香辛料精油的提取及其杀虫、抑菌活性研究［D］.合肥：合肥工业大学， 2019.

［10］美丽，朱懿敏，罗晶，等. 丁香化学成分、药效及临床应用研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2019，25（15）：222-227.

［11］安同伟，陈庆忠，孙建，等. 丁香酚的最优提取方法及药理作用［J］. 山东畜牧兽医， 2013，34（2）：5-6.