骨伤外洗散的薄层色谱及微生物限度检查法适用性实验研究 *

巫繁菁 韦 萍 黄大利 韦 玮

（广西骨伤医院药学部，广西 南宁 530001）

骨伤外洗散是广西骨伤医院使用多年的临床协定方，由苏木、桂枝、当归尾、山香等中药及民族药组成，具有祛风止痛、活络消肿、化瘀的作用，临床上可用于跌打损伤、风湿肿痛，促进骨折愈合。作为传统的散剂，骨伤外洗散制作工艺简单，便于携带。本实验研究旨在对骨伤外洗散的薄层色谱（TLC）以及微生物限度检查进行研究，为该药的生产和质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器紫外光灯（上海嘉鹏科技有限公司，型号：ZF-7）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ5200DB）；电子天平（深圳市华恒仪器有限公司，型号：赛多利斯TP-3102，感量0.1 g）、电热恒温培养箱［宾德环境试验设备（上海）有限公司，型号：BD（E2）240］、细菌培养箱［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：BK6160］、生化培养箱（上海比朗仪器制造有限公司，型号：SANYO MLR-351H）、生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）、高压灭菌锅［致微（厦门）仪器有限公司，型号：GR110DR］。

1.2 材料骨伤外洗散（广西骨伤医院委托其他单位生产提供，批号：20200426、20200427、20200428）；苏木、桂枝、当归尾对照品（购于中国食品药品检定研究院）；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（默克密理博有限公司，批号：VM856858）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（ 默克密理博有限公司， 批号：VM899959）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（北京陆桥技术股份有限公司，批号：181127）；沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）（北京陆桥技术股份有限公司，批号：180731）；pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术股份有限公司，批号：180820）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180509）；溴化十六烷基三甲胺琼脂（广东环凯生物科技有限公司，批号：1066175）；甘露醇氯化钠琼脂（广东环凯生物科技有限公司，批号：1076321）；绿脓杆菌生化鉴定盒（广东环凯生物科技有限公司，批号：5108192）。枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，由中国医学细菌菌种保藏管理中心提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 苏木的TLC鉴别取骨伤外洗散5.5 g，加25 mL甲醇超声20 min，过滤并浓缩至2 mL 作为供试品溶液。取苏木对照药材0.5 g，加甲醇5 mL 超声20 min，过滤并浓缩至2 mL作为对照药材溶液。另取处方量药材，缺苏木，按照骨伤外洗散制备工艺制成缺苏木阴性样品，按供试品方法制成缺苏木阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020 年版一部附录Ⅵ B）进行实验，将以上3 种溶液分别吸取8 μL，点于同一聚酰胺薄膜板上，展开剂为乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（2∶1∶1∶1）溶液，展开后取出晾干，在紫外光灯（365 nm）下检视［1，2］。

薄层结果显示，苏木对照药材与供试品在相同的位置上显荧光斑点且颜色相同，而阴性对照样品无干扰。见图1。

图1 骨伤外洗散中苏木的TLC鉴别图（365 nm下检视）

2.1.2 当归尾的TLC鉴别取骨伤外洗散5.5 g，加25 mL 石油醚超声20 min，过滤并浓缩至2 mL 作为供试品溶液。取当归尾对照药材0.5 g，加5 mL 石油醚超声20 min，过滤并浓缩至2 mL 作为对照药材溶液。另取处方量药材，缺当归尾，按照骨伤外洗散制备工艺制成缺当归尾阴性样品，按供试品方法制成缺当归尾的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020年版一部附录Ⅵ B）实验，将以上3 种溶液分别吸取8 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（5∶1）溶液，展开后取出晾干，在紫外光灯（365 nm）下检视。

薄层结果显示，当归尾对照药材与供试品在相同的位置上显荧光斑点且颜色相同，而阴性对照样品无干扰。见图2。

图2 骨伤外洗散中当归尾的TLC鉴别图（365 nm下检视）

2.1.3 桂枝的TLC鉴别取骨伤外洗散5.5 g，加25 mL甲醇超声20 min，过滤并浓缩至2 mL 作为供试品溶液。取桂枝对照药材1 g，加5 mL 甲醇超声20 min，过滤并浓缩至2 mL作为对照药材溶液。另取处方量药材，缺桂枝，按照骨伤外洗散制备工艺制成缺桂枝阴性样品，按供试品方法制成缺桂枝的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020 年版一部附录Ⅵ B）实验，将以上3 种溶液分别吸取8 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（4∶0.5）溶液，展开后取出晾干，在紫外光灯（365 nm）下检视。

薄层结果显示，桂枝对照药材与供试品在相同的位置上显荧光斑点且颜色相同，而阴性对照样品无干扰。见图3。

图3 骨伤外洗散中桂枝的TLC鉴别图（365 nm下检视）

2.2 微生物限度方法的建立与验证

2.2.1 菌液制备将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在33 ℃条件下培养18～24 h，加入0.9%无菌氯化钠溶液，制成含菌数为104cfu/mL 的菌悬液；将白色念珠菌液体培养物25 ℃培养2～3 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液，制成含菌数为104cfu/mL 的菌悬液；将黑曲霉斜面培养物25 ℃培养5～7 d，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL冲洗霉菌孢子，吸取该菌液，加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，制成含菌数为104cfu/mL 的菌悬液。以上制备好的菌液备用。

2.2.2 供试品制备取骨伤外洗散10 g，按1∶10 加入pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10 供试液；取1∶10 的供试液适量，按1∶20 加入pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶20供试液，备用。

2.2.3 微生物计数法建立及回收率实验

2.2.3.1 适用性实验方法 实验组：取1∶10、1∶20 的供试液每管9.9 mL，分别加入菌液0.1 mL 到每管中，将供试液与菌液混匀（供试液总含菌量≤102cfu/mL）；混匀后每管取1 mL 注皿，平行制备2 个平皿，立即往皿中倾注SDA 和TSA；皿内液体凝固后，在规定温度下培养，真菌5 d，细菌3 d。菌液对照组：以相应的稀释液替代供试液，按实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同实验组操作。

回收比值（回收率）=（实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数。

2.2.3.2 方法的确定 取批号为20200426 的骨伤外洗散样品，以金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及枯草芽孢杆菌为敏感菌，按照2.2.3.1 项下平皿法进行预实验。需氧菌总数采用1∶10、1∶20 供试液平皿法（每皿1 mL），枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2，表明采用1∶10 供试液平皿法（每皿1 mL）进行需氧菌总数测定可行；霉菌和酵母菌总数采用1∶10、1∶20供试液平皿法（每皿1 mL），白色念珠菌回收比值均在0.5～2，表明霉菌和酵母菌总数采用1∶10 平皿法（每皿1 mL）测定可行。见表1。

表1 敏感菌株预实验结果

2.2.3.3 方法验证实验 分别取3 个批号的骨伤外洗散样品，按2.2.1 项下方法制备供试液；以1∶10 供试液、平皿法，按2.2.3.1项下方法进行计数加菌回收实验。

经适用性实验验证，以1∶10 供试液1 mL 平皿法-倾注法，对骨伤外洗散中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数进行计数测定，5 种规定实验菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉）的回收比值均在0.5～2，符合2020 年版《中华人民共和国药典》四部通则1105的规定。见表2。

表2 骨伤外洗散微生物计数方法适用性验证实验结果

2.2.4 3 个批次的骨伤外洗散微生物限度检查根据上述所建立的微生物限度检查法，对3 个批次的骨伤外洗散进行微生物限度检查。见表3。

表3 3批骨伤外洗散的微生物限度检查结果

2.2.5 控制菌检查法适用性实验

2.2.5.1 菌悬液制备 菌液制备同2.2.1。取骨伤外洗散10 g，按1∶10 加入适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为控制菌检查法供试液。

2.2.5.2 金黄色葡萄球菌 实验组：取供试液10 mL，分别接种至100 mL 和200 mL 的TSB 中，同时加入≤102cfu的金黄色葡萄球菌，33 ℃培养18 h。将培养物取出，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，33 ℃培养18 h，观察其菌落形态。阳性对照：取≤102cfu 的金黄色葡萄球菌，接种至100 mL 的TSB 中，依法实验。阴性对照：以相应稀释液作为供试品液，接种至100 mL的TSB中。

2.2.5.3 铜绿假单胞菌 实验组：取供试液10 mL 接种至100 mL 的TSB 中，同时加入≤102cfu 的铜绿假单胞菌，33 ℃培养18 h。将培养物取出，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，33 ℃培养18 h，观察其菌落形态。阳性对照：取≤102cfu 的铜绿假单胞菌，接种至100 mL 的TSB 中，依法实验。阴性对照：以相应稀释液作为供试品液，接种至100 mL的TSB中。

2.2.5.4 控制菌检查验证结果 见表4。

表4 骨伤外洗散控制菌检查方法的适用性验证实验结果

3 讨论

散剂是中医药传统剂型的一种，是将原料药物（或加入适宜的辅料）经粉碎、过筛、混合均匀制成的粉末状制剂［3］。散剂在中医药中的发展有着悠久的历史，且占据重要的一席之地［4］。其以中医药的基本理论为指导，经辨证论治而来，具有制作简单、较好地保留挥发性成分、缩短煎煮时间的优势［5］。骨伤外洗散作为一种传统的散剂，为广西骨伤医院临床独有的治疗跌打损伤、风湿肿痛、骨折的经验方，准备开发为医院制剂。经过资料整理发现，至今尚未有人对该验方进行过质量控制方面的研究。

通过查找相关文献及进行反复实验，本文建立的苏木、桂枝、当归尾的TLC 鉴别方法，操作简便，合理可行，可作为骨伤外洗散的定性鉴别方法；建立的微生物限度检查法回收比值均在0.5～2，符合2020 年版《中华人民共和国药典》的要求，可作为骨伤外洗散的微生物限度检查方法。