LMCD1在结直肠癌组织中的表达及意义

赵晨蕊,何成彦,嵇如月,方 玲

(吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春130033)

结直肠癌(CRC)是全球最普遍和最致命的实体恶性肿瘤之一[1],也是全球癌症相关死亡的第二大常见原因,终生风险约为4%至5%[2]。CRC的发病率和死亡率正在迅速增加[3]。本实验通过二维色谱质谱联用技术和免疫印迹探究大鼠LIM半胱氨酸丰富域蛋白1(LMCD1)在癌组织和癌旁组织中的差异表达及意义,报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

纳入向吉林大学中日联谊医院组织标本库申请的经病理学诊断为结直肠腺癌的新鲜组织标本共24例,术前所有患者均未做任何治疗。所采用的癌旁组织取自同一患者距离癌组织10 cm以上的部位。获取的标本经预冷液体冲洗后,进行液氮速冻并放入-80℃冰箱保存以便日后使用。

1.2 主要仪器与试剂

TPCK修饰的测序级胰酶,高效液相色谱仪,NH4HNO3,DTT,LTQXL 离子阱质谱仪、反向毛细管色谱分析柱,LMCD1单抗,β-actin多抗,BCA定量试剂盒,碘代乙酰胺。

1.3 方法

1.3.1样本蛋白提取及浓度测定 取出-80℃保存的组织样本,在充分研磨后加入提前配制的裂解液并置于冰上半小时,在去除样本中残留DNA和RNA后,14 000 rpm,4℃的条件下离心10 min,吸出上清液并参考BCA蛋白定量试剂盒上的说明书在96孔板内进行加样,于562 nm处进行吸光度测定,根据绘制的标准曲线计算出各个样本蛋白浓度。

1.3.2样本蛋白多肽混合物的制备 取出冻存样本,放至室温下数分钟待其达到平衡后,加入适当量的NH4HNO3和DTT稀释使样本调整浓度为20 mmol/L,避光56℃放置1 h,待反应完全并冷却至室温后加入适当量的IAM使终浓度为50 mmol/L,避光反应0.5 h。按照蛋白与胰酶的比例是50∶1的条件下加入胰酶并将其在37℃水浴箱中培养过夜,所得物放于-80℃冰箱中以待备用。

1.3.3二维色谱质谱联用技术分析 将上述所得物经0.1%的FA溶解后分别对应每组样本取50 μg用于色谱上样,而通过色谱洗脱分离后的蛋白多肽样本经LTQXL离子阱质谱仪的分析后,筛选一定核质比范围最后得到LC/MS图谱。

1.3.4免疫印迹试验 对目的蛋白LMCD1在癌组织及癌旁组织中的差异表达进行检测,对LC/MS图谱的结果进行验证。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结果

本实验通过图谱数差异来衡量癌组织和癌旁组织中同一蛋白的丰度,满足条件为蛋白图谱数比值≥1且蛋白图谱数差值≥72,根据以上的标准,检测到ADRM1、TOMM34、MCM4等18个上调蛋白,HSPB1、CNN1、CKB等15个下调蛋白,通过文献查阅以及生信分析,选取LMCD1作为目的蛋白,且为上调蛋白,质谱图结果见图1。

图1 LMCD1质谱图

2.2 免疫印迹试验结果

LMCD1蛋白差异验证见图2,其在癌组织中蛋白表达量明显高于癌旁组织。

图2 LMCD1蛋白免疫印迹试验结果

3 讨论

CRC是男性和女性中第二大常见癌症,约占全球所有新癌症病例的10%,因其致命危险性使得死亡率快速上升[4],因此未来还需要研究更多的新型标志物和靶点。

LMCD1是LIM蛋白家族的成员,由一个N端富含半胱氨酸的结构域、一个中央PET(Prickle、Espinas和Testin)结构域和两个C-终端LIM结构域组成[5],而且这些结构域通常都会参与蛋白质-蛋白质相互作用[6]。作为细胞调节机制的重要组成部分,学者们对LIM蛋白已经做了大量的相关研究,但对LMCD1的细胞学功能研究却很少[7]。SURESH GOVATATI等[8]研究发现LMCD1通过增强NFTAc1和E2F1启动子的活性,参与HASMC(人主动脉平滑肌细胞)中凝血酶诱导的IL-33的表达和迁移,首次揭示了IL-33是HASMC迁移和损伤时产生的新内膜所必需的物质。朱斌等[9]通过体内外功能研究结果表明LMCD1是一种新的成骨分化调节因子,可能是骨代谢相关疾病的潜在治疗靶点,与对照组相比,LMCD1的下调明显抑制了骨髓干细胞的成骨分化而增强了成脂分化,LMCD1的上调促进了成骨分化而抑制了脂肪形成分化。也有研究结果表明LMCD1突变可以通过Rac1信号通路促进细胞迁移,是HCC(肝细胞癌)转移中潜在的致癌标志物[10]。TCGA分析表明,肝癌组织中LMCD1-AS1(LMCD1反义RNA)的表达水平高于癌旁组织,其表达升高与预后不良有关,敲低和过表达LMLCD1-AS1可以相应地改变let-7g的表达水平进而干扰其靶基因P4HA2在肝癌细胞中的表达[11]。除此之外,LMCD1-AS1还可作为miR-106b-5p的ceRNA促进骨肉瘤的发展,影响其存活率[12]。其他学者研究表明E2F1可以直接与LMCD1-AS1的启动子区域结合并激活其转录,阻碍胆管癌细胞(CCA)的增殖和侵袭,诱导癌细胞的凋亡,E2F1/LMCD1-AS1/miR-345-5p/COL6A3轴在胆管癌肿瘤发生和进展中发挥作用,为CCA提供潜在的治疗靶点[13]。

本实验通过LC-MS和Westen blot技术对蛋白在结直肠癌中的差异表达进行了分析验证,确定了LMCD1在结直肠癌中高表达,这可能成为结直肠癌诊断和筛查中的一个新的潜在生物靶点,后续还需要下一步的实验探索。