使用不同胰酶消化PK15细胞对比试验

2018-03-01张小兰

福建畜牧兽医 2018年1期

张小兰

福州大北农生物技术有限公司福州 350014

PK15 细胞（Porcine Kidney Eplithelial cells），也称PK15或PK（15）。来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，父母代源自1955年美国Stice提供的成年猪肾细胞 PK-2a，被 ATCC 收藏（CCL-33）[1]。 PK15细胞对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等多种病毒比较敏感，已广泛应用于兽用疫苗的研究和生产[2]。PK15细胞是已经癌变了的细胞，具有很强的生长和增殖能力，正常情况下可以无限地传代[3]。但在实际培养中，细胞常常会出现不稳定的生长情况，反复传代后，随着传代次数的增多，可能出现细胞慢慢表现为生长不良、细胞变老、状态变差直至不能继续传代等情况。在实际生产传代中发现，细胞消化是影响细胞生长状态好坏的关健因素之一。胰蛋白酶是细胞原代培养和传代过程中经常用到的水解酶[4]，其通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞在自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。不同组织或细胞对胰酶的作用反应不一样，且胰酶分散细胞的活性与其种类、浓度、温度和作用时间、消化程度、消化液残留量等都有关。所以，为了给生产疫苗提供更好细胞状态的PK15细胞，提高疫苗质量，本试验通过对比胰酶A与胰酶B的消化效果及对细胞的影响，目的在于寻找一种对细胞更温和、损伤更小的消化液，为生产疫苗提供优良状态的细胞。

1 材料与方法

1.1 细胞 PK15细胞株，大北农集团北京动物医学研究中心提供。

1.2 培养基 MEM购自gibco公司。

1.3 细胞消化液 0.25%胰酶A与0.25%胰酶B均购自某公司。

1.4 试验方法

1.4.1 细胞制备取一瓶处于对数生长期、细胞状态良好的PK15细胞进行消化传代，按一定的分种比例分出8瓶等量的T75细胞。随机分为a、b、c、d四组，每组2瓶T75细胞。

1.4.2 细胞消化各组细胞培养72 h后，使用胰酶A对a、b组细胞进行消化，即弃去细胞培养液，用37℃预热处理的PBS清洗细胞两遍，每遍25 mL，再用胰酶A 4 mL消化细胞，待细胞出现圆缩分离时，a组细胞消化完弃去消化液，加6 mL含5%血清的营养液终止消化并进行吹打细胞，分种后进行培养，b组细胞消化后不弃去消化液直接加入营养液终止消化，分种后进行培养。使用胰酶B对c、d组细胞进行消化即弃去细胞培养液，用37℃预热处理的PBS清洗细胞两遍，每遍25 mL，再用胰酶B 4 mL消化细胞，待细胞出现圆缩分离时，c组细胞消化完弃去消化液，加6 mL含5%血清的营养液终止消化并进行吹打细胞，分种后进行培养，d组细胞消化后不弃去消化液直接加入营养液终止消化，分种后进行培养。

1.4.3 观察记录记录各组细胞消化终止时间、细胞分散效果，以及培养24 h、48 h、72 h时细胞的生长状态等。

2 结果

2.1 胰酶A与B对细胞消化的影响胰酶A的消化终止时间为5～6 min，胰酶B的消化终止时间为1～2 min，消化终止时间上相差较大。细胞消化后，胰酶A的分散效果均较好，呈大部分几个细胞状态，24 h细胞分裂也明显，细胞状态较好。胰酶B消化细胞，消化液弃去的细胞消化后基本处于单个状态，24 h细胞分裂也明显；但消化液不弃的团块较大，24 h生长不均匀，细胞分裂不明显，细胞生长较慢。见表1。

2.2 胰酶A与B对细胞生长状态的影响使用胰酶A消化PK15细胞，无论消化液弃去还是不弃去，细胞生长情况与细胞状态都较理想。使用胰酶B消化细胞时，消化液弃去，细胞生长状态好，与胰酶A差异不明显；而消化液不弃去，细胞状态变差、生长变缓慢，到72 h时，细胞才长到约80%密度，细胞有圆缩脱落现象。见表2。

3 小结与讨论

1）试验结果表明，使用0.25%胰酶A消化PK15细胞，无论消化液是否弃去，消化终止时间较0.25%胰酶B更长，细胞分散效果均处于几个细胞状态，细胞生长状态好。使用0.25%胰酶B消化PK15细胞，当消化液弃去时，细胞分散情况与细胞生长状态都较好；而消化液不弃时，细胞消化后团块大，生长变缓慢、状态变差，这应该与胰酶B对细胞的毒性有关，当胰酶残留量大时，对细胞有一定的损伤，导致细胞状态变差、生长缓慢。而胰酶A比较温和，即使有残留，对细胞损伤不大，细胞仍能稳定生长。所以，0.25%胰酶A较0.25%胰酶B温和，消化液弃去与否，细胞的消化与生长都理想。

2）胰酶B为动物源性的消化酶，而胰酶A是利用微生物生产的一种比较温和的非动物源性消化酶，其动力学性质和裂解特异性均与胰酶B类似[5]。但胰酶A纯度更高，室温保存稳定性高，对细胞损伤更小。本试验使用0.25%胰酶A、0.25%胰酶B消化PK15细胞，通过对比了解两种胰酶对PK15细胞消化和生长的影响，为实际生产提供参考依据。