基于网络药理学探究葛根芩连汤异病同治的机制研究

王 鑫 刘旭妍 蒋广祥 侯来永 尹 珏※ 郑 爽

异病同治是传统的中医理论,即不同的疾病出现相同的病因病机可采用相同的治疗方法。在西医知识体系中往往是专病专治,很少使用异病同治的治疗思路。溃疡性结肠炎、肠易激综合征、2型糖尿病等都有特定的西医治疗方案,但是在中医治疗可以采用相同的治疗方法,达到治疗不同疾病的目的。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因及发病机制复杂的炎症性肠道疾病。中医治疗UC可缓解症状,且预防复发有较好的临床疗效。Fan Y、洪顺芳等[1,2]在临床研究中发现应用葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎可进一步提高疗效。肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种临床常见病,可显著影响患者生活质量。中医学中,IBS属于腹痛、泄泻范畴,Li C Y[3]的研究发现中医治疗IBS疗效确切,且效果优于单纯的西药治疗。司徒淳羽、袁兵等[4,5]在临床研究中应用葛根芩连汤治疗IBS,发现治疗组生活质量评分等明显优于对照组。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)是一种代谢性疾病,以高血糖为主要特征。在2型糖尿病的中医治疗中多种处方均有不错的效果,与西医治疗结合更容易得到患者的认可,有见效快、副作用小等多重优势。Yuhang Ren等[6,7]在研究中发现,在西医常规治疗基础上联合葛根芩连汤治疗2型糖尿病可显著提高治疗有效率。

葛根芩连汤源自张仲景《伤寒论》第34条:“太阳病,桂枝证……葛根黄芩黄连汤主之”[8]。该方由葛根、黄芩、黄连、甘草四味药组成,属清热药,可解表清里,主治身热下利,胸脘烦热,口感作渴,喘而汗出等证。刘莲萱[9]等基于药物成分和药效关联Q-maker研究发现葛根素、黄芩素、黄连碱等14个成分是葛根芩连汤的药效物质基础。池美华等[10,11]研究发现,葛根芩连汤被应用于消化系统和内分泌系统等多种疾病。因此,葛根芩连汤是异病同治的典型用药,现有研究重点多在“葛根芩连汤治疗2型糖尿病”上,对于其异病同治的原理与机制研究相对较少。

本研究旨在通过网络药理学研究葛根芩连汤异病同治的分子学基础,为葛根芩连汤治疗多种不同疾病提供理论支持,同时结合葛根芩连汤对多种疾病临床研究的结果,总结葛根芩连汤的疗效。

1.方法

1.1 获取葛根芩连汤有效成分及靶点

运用中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)检索葛根芩连汤中葛根、黄芩、黄连、甘草四味中药的所有化学成分。筛选口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug-like,DL)≥0.18的化合物及其作用靶点。利用Uniport数据库对TCMSP获取的靶点进行标准化和统一。

1.2 获取溃疡性结肠炎、肠易激综合征及2型糖尿病和葛根芩连汤的共有靶点

通过GeneCard数据库搜索3个疾病的相关靶点,筛选关联度大于1的基因靶点。对药物靶点与筛选后的疾病靶点取交集,得到溃疡性结肠炎、肠易激综合征及2型糖尿病和葛根芩连汤的共有靶点。

1.3 网络构建

以“1.1”和“1.2”得到的有效成分、共有靶点、药物为节点,导入CytoScape3.8.1软件中构建“葛根芩连汤-有效成分-共有靶点”相互作用网络模型。

1.4 蛋白质相互作用网络

将“1.2”中得到的共有靶点输入至String网站构建并绘制蛋白质相互作用关系图(PPI),设置confidence score值为0.900,将PPI网络以TSV格式导入CytoScape3.8.1软件中进行可视化处理。

1.5 生物学功能及通路富集分析

用Metascape数据库对共有基因进行基因本体分析(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)。

1.6 筛选通路的关键靶标

将关键通路靶点分别导入String 11.0数据库。用Cytoscape3.6.0软件进行Network Analysis网络拓扑分析,根据度值(Degree)筛选出关键靶标。

2.结果

2.1 葛根芩连汤中有效成分筛选及靶点的获取

将葛根芩连汤中葛根、黄芩、黄连、甘草4味中药上传至TCMSP数据库,按照OB≥30%,且DL≥0.18的筛选标准,葛根芩连汤中有146个活性化合物,去重后共获得242个药物作用靶点。见表1。

表1 葛根芩连汤药物作用靶点TOP50

2.2 葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎、肠易激综合征和2型糖尿病的共有靶点获取

通过GeneCards数据库搜集UC、IBS、T2DM 3种疾病的相关靶点,获得UC靶点4852个,IBS靶点3166个,T2DM靶点8806个,筛选Relevance score≥1的靶点之后,UC靶点188个,IBS靶点1048个,T2DM靶点4500个。疾病靶点与葛根芩连汤的242个靶点取交集,最后得到共有靶点33个,并绘制Venn图。见图1,表2。

图1 葛根芩连汤与UC、IBS、TDM交叉Veen图

表2 葛根芩连汤与UC、IBS、TDM重合基因靶点

2.3 葛根芩连汤治疗UC、IBS、T2DM网络图

将“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶点导入Cytoscape 3.8.2软件后,构建“中药-有效成分-共有靶点”网络图。见图2。

图2 葛根芩连汤-有效成分-共有靶点网络图

2.4 对共有靶点进行分析

将33个共有靶点导入STRING数据库,构建共有靶点的蛋白质相互作用关系网。以TSV格式导入Cytoscape软件,用“Analyze Network”功能计算各靶点的度值(Degree),平均值为20.61,排在前4位的蛋白分别是AKT1(Degree=30),TNFRSF1A(Degree=23),HMOX1(Degree=23),MMP2(Degree=23)。见图3。

图3 葛根芩连汤治疗UC、IBS、T2DM共有靶点蛋白相互关系网络图

2.5 葛根芩连汤与UC、IBS及T2DM交集基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析

GO富集分析结果显示,生物过程(Biological Process,BP)20个,主要涉及蛋白质磷酸化,炎症反应细胞凋亡、细胞迁移等。见图4。

图4 葛根芩连汤治疗UC、IBS、T2DM的GO功能富集分析

2.5.2 KEGG分析

KEGG信号通路分析获得P<0.01、最小计数为3且富集因子>1.5的通路16条,包括癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路等。见图5。

图5 葛根芩连汤治疗UC、IBS、T2DM的KEEG富集分析

3.讨论

在临床治疗中,西医通过对相关指标的收集对患者疾病进行诊断,进而按照相应的治疗规范进行治疗;区别于西医,中医更关注辨证论治。不同的疾病在发生发展过程中,可出现相同的病机,从而采取相同的治疗方法,即异病同治。

在本研究中,我们同时对其分子机制进行探索,通过TCMSP的筛选及靶点预测,并与溃疡性结肠炎、肠易激综合征、糖尿病靶点进行映射,最终得到了33个有效靶点。有效靶点对应的活性成分排名前三的依次是槲皮素(quercetin)、异黄酮(formononetin)、山柰酚(kaempferol)。这三种成分均为黄酮类化合物,可能是葛根芩连汤发挥异病同治的主要成分。黄连、黄芩、甘草三味中药中都包含槲皮素。槲皮素有多重生物活性,可发挥抗动脉粥样硬化、抗癌及抗炎作用[12],可有效抑制结肠炎性损伤。槲皮素可抑制HMGB1和TLR4蛋白和基因的表达抗动脉粥样硬化[13],可发挥降脂作用,调节胆固醇含量[14]。另一方面槲皮素可以降低甘油三酯的水平,提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等酶的活性[15]。Jeong SM等[16]的研究中发现槲皮素通过AGE-RAGE信号通路发挥作用,可以有效改善2型糖尿病的高糖高脂血症。Sotniknova R[17]发现黄酮化合物有抗氧化特性,且槲皮素抗氧化能力强,其研究证明槲皮素衍生物可有效抑制结肠炎症损伤。异黄酮与山茶酚分别存在于葛根和甘草中。异黄酮具有抗癌与抗心血管疾病的作用[18],可抑制NF-kB信号通路的激活,降低黏附分子mRNA的水平和蛋白表达量,从而发挥抗动脉粥样硬化作用[19]。山柰酚有抗癌、降低血糖作用[20],可增强抑癌基因活性,诱导肿瘤细胞凋亡;Park M Y[21]认为山柰酚是一种有效的抗炎药,对结肠黏膜有保护作用;同时山柰酚被认为是新一代用于2型糖尿病治疗的胰岛素增敏剂[22],可改善糖尿病内皮功能障碍,有效预防2型糖尿病并发症的产生与发展。以上3种物质均属于黄酮类化合物,有抗氧化和抗炎作用,可对UC和IBS起到治疗作用,其中槲皮素与山柰酚可有效作用于T2DM。通过抗癌、抗动脉粥样硬化及AGE-RAGE等作用进行干预,发挥异病同治作用。

对共有靶点进行拓扑分析并筛选出核心靶点12个,排名靠前的依次是血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素-8(CXCL-8)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT1)。陈翠连等[23]在研究炎症性肠病与心血管疾病的关系时发现炎症反应在动脉粥样硬化与溃疡性结肠炎的发病机制中发挥着必不可少的作用,持续的炎症反应会导致动脉粥样硬化水平升高。同时VEGFA可促进新血管生成,与动脉粥样硬化通路有着密不可分的关系。Zhen Y等[24]发现白细胞介素参与肠易激综合征的病理过程,其中CXCL-8是IBS的重要促炎因子,可诱发和促进肠道黏膜炎性反应。CXCL-8还可介导IL-1、TNF-α等炎性因子的表达,炎性因子与肠道菌群相互作用,加快IBS病理进程。循环中CXCL-8水平的升高与T2DM有一定相关性,CXCL-8升高可以诊断炎症状态和代谢较差的患者[25]。AKT是胰岛素信号通路下游的效应因子,可被胰岛素、胰岛素生长因子激活[26]。AKT分子上调,通过多种通路的联合作用最终达到降糖的目的,改善胰岛素抵抗。此外PI3K-AKT信号通路,参与促炎性因子的释放[27],同时可激活NF-kB,介导肠道炎症反应和黏膜损伤[28],当此通路过度活化时会诱导溃疡性结肠炎癌变[29]。

综上所述,葛根芩连汤治疗疾病是通过动脉粥样硬化、癌症通路、AGE-RAGE通路发挥作用。VEGFA、CXCL-8及AKT1在发挥本身生化作用的同时,通过激活相关通路的其他靶点联合作用起到相关作用,临床治疗效果十分显著。本研究通过网络药理学对葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎、肠易激综合征及2型糖尿病的共同作用机制进行了探讨,为异病同治提供了药理机制层面的理论支持,为临床应用提供了一定的科学依据,也为进一步的通路研究、机制研究的具体实验提供了参考。本研究只是在分子层面进行预测,尚未进行相关实验的验证,仍需提供相关理论依据做出进一步验证。